張佑紅，楊 文，危 威，徐智鵬，蘇騰甲

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進行重組蛋白、疫苗和生物殺蟲劑的大規(guī)模生產(chǎn)越來越受到人們的重視[1]，因此需要對其生產(chǎn)過程進行優(yōu)化.近年來,人們主要在以下幾個方面進行了優(yōu)化：a.細(xì)胞生長情況[2]；b.培養(yǎng)基[3-4]；c.溶氧；d.反應(yīng)器的設(shè)計[5]；e.感染策略[6-9]，其中包括感染復(fù)數(shù)(MOI)、感染時間 (TOI)、細(xì)胞初始濃度(ICD)和培養(yǎng)基的替換.利用高感染復(fù)數(shù)進行重組蛋白和病毒殺蟲劑的生產(chǎn)過程已經(jīng)很清楚，在高感染復(fù)數(shù)條件下，所有細(xì)胞都“同步”感染[10].但在實際生產(chǎn)中，采用低感染復(fù)數(shù)有以下優(yōu)點[11]：a.可以大大減少病毒原種的用量，無需大量擴增培養(yǎng)，從而減少設(shè)備投資， 縮短工藝流程，降低生產(chǎn)中受污染的概率;b.減少了由于高復(fù)數(shù)感染引起的“傳代效應(yīng)”.而且據(jù)相關(guān)報道， 在高感染復(fù)數(shù)下獲得的重組蛋白的產(chǎn)量比低感染復(fù)數(shù)下低.因此，低感染復(fù)數(shù)下桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞的研究日益受到重視.本研究將在氣升式反應(yīng)器中對感染策略的4個方面 (不包括培養(yǎng)基的替換)： MOI、TOI、ICD和DO 進行優(yōu)化.研究感染策略的文獻一般只考察單因素對昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)體系的影響.本研究將采用正交實驗來進行感染策略的優(yōu)化，這種方法的優(yōu)點是它不僅考慮了單因素對昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)體系的影響，而且考慮到了各個因素間的相互影響.這樣得到的結(jié)果對實際生產(chǎn)有更大的參考價值.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 Grace 培養(yǎng)基 (GBICO公司)、胎牛血清(GBICO公司)、酵母提取物及脂類復(fù)合物 (GBICO公司)、Pluronic F-68(GBICO公司).培養(yǎng)基組成: Grace 培養(yǎng)基，5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的胎牛血清，1% 的酵母提取物，1.5% 的脂類復(fù)合物，0.1%的 Pluronic F-68.貼壁培養(yǎng)、搖瓶懸浮培養(yǎng)和氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)的培養(yǎng)基相同.

1.1.2 細(xì)胞、病毒及其計數(shù) 棉鈴蟲細(xì)胞HzAM1由中國科學(xué)院武漢病毒所提供的美洲棉鈴蟲細(xì)胞系.將棉鈴蟲細(xì)胞HzAM1在含體積分?jǐn)?shù)5%(正常的情況是10% )胎牛血清的Grace 培養(yǎng)基于 27 ℃下恒溫培養(yǎng).將細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%臺盼藍(lán)染色后用血球計數(shù)板計數(shù),計算活細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率.棉鈴蟲病毒 [ Helicoverp a armiger a single nucleocapsid nucleopolyhedro virus(HaSNPV )]由中國科學(xué)院武漢病毒所的王華林教授提供,由該所構(gòu)建提供的棉鈴蟲病毒(HaBacHZ8-eGPF-PH)帶有綠色熒光蛋白(eGFP).包涵體病毒濃度利用血球計數(shù)板在高倍顯微鏡下計數(shù),使用流式細(xì)胞儀測定非包涵體病毒滴度[12].

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 常規(guī)儀器 2001 型振蕩慍溫培養(yǎng)箱(常州國華電器有限公司),熒光顯微鏡(Olympus BX-51),倒立式顯微鏡(XDS-1B ),流式細(xì)胞儀(BD公司) 超低溫冰箱(New Brunswick Scientific),無油空氣壓縮機(揚州市恒順機械廠),氧氣瓶、氮氣瓶(青島華青集團有限公司),pH 探頭、氧探頭(Broadley James 公司),其他均為實驗室常規(guī)儀器.

1.2.2 氣升式反應(yīng)器 本實驗室設(shè)計的氣升式反應(yīng)器總體積570 mL，有效體積500 mL.配備有一個溶氧探頭和一個pH探頭,中間有4根金屬導(dǎo)管,它們的作用分別是通氣、取樣、放氣和加料.通氣導(dǎo)管從容器底部通入無菌的空氣、氧氣和氮氣,它的作用主要有兩個：通入的氣體推動溶液在反應(yīng)器中循環(huán)流動,使細(xì)胞懸浮生長；通過空氣、氧氣和氮氣的比例來調(diào)節(jié)溶氧的大小.通過計算機自動控制反應(yīng)器中的溶氧值和pH值.

1.3 實驗方法

將生長良好的細(xì)胞接種在100 mL的搖瓶中在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng).其中接種體積為25 mL，培養(yǎng)溫度為27 ℃，轉(zhuǎn)速為80 r·min-1.每12 h取樣在血細(xì)胞計數(shù)板上測定細(xì)胞濃度，待細(xì)胞濃度達(dá)到實驗要求后轉(zhuǎn)入氣升式反應(yīng)器中培養(yǎng).本實驗設(shè)計了正交實驗，四因素為感染復(fù)數(shù)、感染時間、細(xì)胞初始濃度和溶氧值.每個因素設(shè)計了3個水平.正交實驗水平見表1.

表1 正交實驗因素與水平

其中ICD為細(xì)胞接種氣升式反應(yīng)器時的細(xì)胞濃度，而不是細(xì)胞被感染時的細(xì)胞濃度.TOI為細(xì)胞處于對數(shù)生長期的初期、中期、晚期.

根據(jù)以上的正交表，一共進行了9組實驗，細(xì)胞接種氣升式反應(yīng)器后，每24 h采樣測定活細(xì)胞濃度及細(xì)胞存活率，接種病毒后，每6 h采樣測定BV滴度和OV濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)分析

圖1 不同細(xì)胞初始濃度下的BV病毒滴度Fig.1 Evolution of minus logarithm of TCID50 under different ICDs

圖2 不同細(xì)胞初始濃度下的OV病毒濃度Fig.2 Evolution of amount of OVs under different ICDs

編號ICD(A)/(105 cells·mL-1)MOI(B)TOI(C)DO(D)BVmax/(105 TCID50·mL-1)OVmax/(104 OVs·mL-1)111115.011282122212.59138313333.16124421233.981285223179.431686231225.1214073132101348321315.851469332125.12152k16.926.3315.3336.52k236.1835.9613.915.9k31717.830.867.66R29.2629.6316.9628.86k′1130130140149.3k′2147.3150.7139.3137.3k′3144132.7142132.7R′17.320.72.716.6

2.2 ICD、MOI、TOI和DO對BV和OV滴度的影響

3 結(jié) 語

本研究是針對低感染復(fù)數(shù)下昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)體系在氣升式反應(yīng)器中的感染策略優(yōu)化，對BVs和OVs產(chǎn)量的影響考察了4個因素：MOI、ICD、DO和TOI.采用正交實驗來選擇最佳感染條件，結(jié)果表明MOI對BVs和OVs產(chǎn)量影響最大，ICD次之，DO次之，TOI對BVs和OVs影響最小；最佳感染條件為：MOI為0.1，ICD為2×105cells·mL-1，DO為10%，TOI為細(xì)胞生長對數(shù)期晚期，得到了較高的BV滴度為7.943×106TCID50·mL-1.但是本研究并沒有在更低的DO環(huán)境下優(yōu)化，而在低感染復(fù)數(shù)下細(xì)胞處于對數(shù)生長期初期對病毒的產(chǎn)量有更好的感染循環(huán).因此在下一步的工作中，可以在低DO、TOI為細(xì)胞生長對數(shù)期初期進行優(yōu)化，可能獲得更高的BV滴度和OV濃度.此外，本研究討論了MOI、ICD、DO和TOI的相互關(guān)系及對病毒產(chǎn)量的影響.這為昆蟲病毒殺蟲劑的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一定的根據(jù).

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