李 權(quán)，徐 敏，李 艷，李清漢

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563000)

輔助生殖技術(shù)目前已經(jīng)成為治療不孕癥的重要治療手段，使先前認(rèn)為不能生育的夫婦擁有健康的子女，但是輔助生殖的并發(fā)癥——卵巢過度刺激綜合征是其主要的并發(fā)癥，國內(nèi)報(bào)道，卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發(fā)生率為23.3% ，其中重度為1% ～2%［1］。因其發(fā)生相對治療來說相對滯后，由于倫理因素難以在人體進(jìn)行，嚴(yán)重地制約該病的研究。目前國內(nèi)外均有注射馬促腺性激素建立大鼠卵巢過度刺激綜合征的動(dòng)物模型，且已用該模型對馬促腺性激素的發(fā)病及治療進(jìn)行相關(guān)的研究，取得了一定的效果。但因目前國內(nèi)外對馬促腺性激素的生產(chǎn)已經(jīng)停止，獲取馬促腺性激素相對較困難，需要尋找另一種激素制備OHSS的動(dòng)物模型，更好地探索OHSS藥物治療效果及其發(fā)生的具體機(jī)制，我們用重組人促卵泡激素(Recombinant Human Folli-tropin Alfa Solution for Injection，r～hFSH)刺激Wistar大鼠制備了OHSS的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)未發(fā)育雌性Wistar大鼠22日齡，體重42.0～45.0g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 EB 染料 Evens blue(EB，Sigma);Recombinant Human Follitropin Alfa Solution for Injection(rhFSH，Merck Seromno S.p.A.);human chorionic gonadot rophin(hCG;麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)。

1.3 方法 將20只22日齡雌性Wistar大鼠隨機(jī)分成兩組，每組10大鼠。實(shí)驗(yàn)組10只未發(fā)育雌性Wistar大鼠在第22～25日齡每日上午08∶30均腹腔注射10IU r～hFSH(用0.1 ml NS稀釋)，第26日齡上午08∶30皮下注射hCG 30 IU(用0.1 ml NS稀釋);對照組10只未發(fā)育雌性Wistar大鼠在第22～26日齡每日上午08∶30均腹腔注射0.1 ml NS。實(shí)驗(yàn)組與對照組在第28日齡上午08∶30經(jīng)尾靜脈注射1%EB染料0.1 ml，30 min脫頸法處死大鼠后立即腹水評(píng)分，無腹水或少量腹水者向腹腔灌注5 ml NS，灌注液收集10 ml試管中，均稀釋到10 ml，再加入 0.05 ml 0.1 NaOH 液，以1000 r/min的速度在室溫下離心10 min，用721分光光度計(jì)在波長600 nm處行比色測定，記錄OD值。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腹腔毛細(xì)血管通透性 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度及其OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出腹腔沖洗液EB含量。

1.4.2 腹水評(píng)分 大鼠脫頸法處死后，切開腹壁，參考Leng［2］的方法進(jìn)行腹水評(píng)分:1分:無腹水;2分:少量腹水存在;3分:中量腹水存在;4分:腹水明顯存在;5分:大量腹水存在或腹水從腹部切口溢出。

1.4.3 卵巢重量測量 取下雙側(cè)卵巢后立即用電子天平稱重并記錄其重量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，差異比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組Wistar大鼠與對照組Wistar大鼠在第22日齡是體重分別42.0±1.05g與42.0±1.06g，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。兩組經(jīng)過上述注射藥物(實(shí)驗(yàn)組)或生理鹽水(對照組)后第28日齡時(shí)檢測腹腔EB含量、卵巢重量和腹水評(píng)分均有差異(P＜0.001)，(見表1)。

表1 兩組腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水評(píng)分比較(s)

表1 兩組腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水評(píng)分比較(s)

注:*:與對照組有差異，P＜0.001

組 別 腹腔液中EB含量(μg/ml)卵巢重量(mg)腹水評(píng)分實(shí)驗(yàn)組 4.324 ±0.372*389.00 ±23.30 *2.43 ±0.34*對照組0.312 ±0.032 29.37 ±4.26 1.00 ±0.00

3 討論

OHSS是因?yàn)楦淖兂０l(fā)生在輔助生殖促排卵治療過程中，也偶發(fā)生在正常的多胎妊娠中，因此認(rèn)為與促腺性激素有關(guān)，但在診斷前其發(fā)生仍有不可預(yù)知性，是輔助生殖過程中最嚴(yán)重的一種臨床綜合征，臨床表現(xiàn)主要包括卵巢增大、腹水及胸水，嚴(yán)重者因可出現(xiàn)生命危象而終止移植或放棄治療周期。目前OHSS發(fā)生的病理生理機(jī)制還沒有完全闡明，研究認(rèn)為促排卵藥物刺激后引起卵巢分泌血管活性物質(zhì)的釋放導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性的增加是本病發(fā)生的關(guān)鍵因素［3］。由于常發(fā)生在輔助生殖過程中，由于倫理因素，OHSS的病理生理研究進(jìn)展緩慢，需要復(fù)制動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

國外的OHSS模型大多選擇恒河猴為造模對象［4］，但是價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，模型技術(shù)不易推廣;國內(nèi)選擇未發(fā)育雌性Wistar大鼠以馬促腺性激素建立OHSS的動(dòng)物模型獲得成功［5］，并在該動(dòng)物模型上進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究和藥物試驗(yàn)，均取得了較好的效果［6］。限于馬促腺性激素目前國內(nèi)購買相對困難，而r-hFSH在臨床上廣泛應(yīng)用，因此我們選擇用中國倉鼠卵細(xì)胞經(jīng)遺傳工程生產(chǎn)的促腺性激素(r～hFSH)代替馬促腺性激素，參照付永倫等［5］的文獻(xiàn)建立OHSS的動(dòng)物模型方法。研究結(jié)果顯示在促腺性激素與生理鹽水對照試驗(yàn)前Wistar大鼠體重?zé)o明顯差異條件下，試驗(yàn)組每日經(jīng)r-hFSH刺激后hCG促排卵，對照組生理鹽水替代激素行相同的試驗(yàn)過程。在hCG注射后48h，即Wistar大鼠第28日齡時(shí)比較兩組的卵巢重量、腹水評(píng)分和腹腔中EB濃度均有顯著性差異，表明腹腔通透性在實(shí)驗(yàn)組明顯增加，卵巢體積因卵泡的發(fā)育和通透性增加使重量增加，體積增大，與付永倫等［5］用馬促腺性激素結(jié)果一致，與Golan［7］的卵巢過度刺激綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)相符，說明我們成功制備了OHSS模型。

建立OHSS的動(dòng)物模型對該病進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究，是生殖醫(yī)師正確認(rèn)識(shí)和研究超排卵導(dǎo)致OHSS病理生理和探討臨床治療的主要手段之一。該動(dòng)物模型的成功制備，可以研究OHSS的發(fā)生發(fā)展及病理生理過程，可以為研究藥物對OHSS的治療效果提供方便有效的手段，我們正在利用該模型進(jìn)行相關(guān)的病理生理的基礎(chǔ)研究。

［1］莊廣倫.現(xiàn)代輔助生育技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，408-411.

［2］Leng P，Ho Yuen B，Moon YS.Effect of prolactin in an experimental model of the ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Am J Obstet Gynecol，1983，145:847-849.

［3］Ohba T，Ujioka T，Ishikawa K，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome model rats，the manifestation and clinical implication［J］.Molecular and Cellular Endocrinology ，2003，202:47-52.

［4］Molskness T A，Stouffer R L，Burry KA，et al.Circulating levels of free and total vascular endothelial growth factor(VEGF)-A，soluble VEGF receptors-1 and-2 ，and angiogenin during ovarian stimulation in nonhuman primates and women［J］.Hum Reprod，2004，19:822-830.

［5］付永倫，林其德，仲汗威.卵巢過度刺激綜合征大鼠模型建立［J］.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2002，22(1):16-18.

［6］付永倫，林其德.RU486 OHS模型大鼠血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)生的作用［J］.生殖與避孕，2005，25(5):263-267.

［7］Golan A，Ronel R，Soffer Y，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome:an update review［J］.Obstet Gynecol Survey，1989，44:430-440.