劉艷枚，劉小慧，方 寧，劉金偉，章 濤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院暨貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用寄托了各種難治性組織損傷疾病治療的新希望［1，2］。除了干細(xì)胞直接移植應(yīng)用外，將干細(xì)胞作為基因治療的載體，由此形成基因與干細(xì)胞的聯(lián)合也是重要的新的研究關(guān)注點(diǎn)［3］。這一治療新策略成功的前提是選擇易于病毒載體轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞類型，并將病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞帶來的可能傷害降至最低。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived－mesenchymal stem cells，BMMSCs)是最具應(yīng)用前景的成體干細(xì)胞來源，在肢體缺血性疾病等的治療應(yīng)用研究中已取得了理想的結(jié)果［4］。最近，已有采用基因修飾BM-MSCs的治療實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，初步證實(shí)了采用BM-MSCs攜帶外源基因治療的可行性［5］。本研究選擇具有促進(jìn)血管新生的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，用腺病毒介導(dǎo)VEGF基因轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs，通過轉(zhuǎn)染報(bào)告基因表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性檢測等評(píng)價(jià)該策略的可行性，為VEGF基因修飾大鼠BM-MSCs移植治療糖尿病下肢缺血等慢性缺血性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞株 含人VEGF165基因腺病毒表達(dá)載體Ad-VEGF165與空載體Ad-GFP均由蘇州大學(xué)楊吉成教授惠贈(zèng);HEK293細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室存留。

1.2 主要試劑與儀器 FITC anti-rat CD29、PE anti-rat CD90和PE anti-rat CD45購自BioLegend公司;LG-DMEM培養(yǎng)基、HG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自 Sigma公司。主要儀器:FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson);Leica Mirb倒置熒光顯微鏡 (Nikon);Vi-CELLTM XR細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Beckman Coulter)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合有關(guān)倫理要求。

1.4 大鼠BM-MSCs的分離培養(yǎng)與免疫表型分析 頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無菌條件下切取雙側(cè)完整股骨，剪開其兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔并收集沖洗液，1500 rpm離心5 min，棄上清，用含 10%FBS和 10 ng/ml的 bFGF的 LGDMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于Corning T25一次性塑料培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)48 h首次換液，去除懸浮生長細(xì)胞。當(dāng)貼壁細(xì)胞生長匯合度達(dá)80% ～90%時(shí)(通常為原代培養(yǎng)5～6 d)，采用0.125%胰蛋白酶消化，按5×105個(gè)/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代BM-MSCs進(jìn)行表型標(biāo)志物CD45、CD29和CD90流式細(xì)胞儀分析。

1.5 攜帶人VEGF基因腺病毒表達(dá)載體的擴(kuò)增與效價(jià)分析

1.5.1 Ad-VEGF165擴(kuò)增 采用含 10%FBS的HG-DMEM和T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)50% ～80%時(shí)，從-20℃冰箱中取出Ad-VEGF165，放入37℃水浴箱中孵育15 min，取100 μl病毒液加入到1個(gè)棄培養(yǎng)基的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，作用1 h后，加入3 ml含2%FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。病毒轉(zhuǎn)染48 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞成葡萄狀聚集時(shí)即可收集細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，留少許培養(yǎng)液的細(xì)胞沉淀置－80℃冰箱和37℃水浴箱反復(fù)凍融3次，使病毒從細(xì)胞中充分釋放，再將凍融液2000 rpm離心5 min，收集含病毒的上清液(約0.5 ml)，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 Ad-VEGF165效價(jià)檢測 采用96孔板，每孔接種100 μl密度為1×105/ml的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，將上述步驟擴(kuò)增收獲的Ad-VEGF按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀釋后，每孔加10 μl病毒稀釋液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18 h，置熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，按下述公式計(jì)算制備的病毒原液的病毒效價(jià):病毒效價(jià)(pfu/ml)=(平均熒光數(shù)×10)/相應(yīng)稀釋度。選擇病毒效價(jià)≥108以上者用于后續(xù)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.6 Ad-VEGF165體外轉(zhuǎn)染BM-MSCs 取第3代BM-MSCs，用6孔板，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長匯合度達(dá)50%～80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，取上述步驟擴(kuò)增的重組腺病毒，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為 20、50、100、200 的Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs，并加含2%FBS和10 ng/ml bFGF的 LG-DMEM 培養(yǎng)基400 μl，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使病毒混懸液均勻平鋪于細(xì)胞上，1 h后再補(bǔ)加1.6 ml相同培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h及48 h后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率，結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力觀察，以確定理論的MOI值。注:轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)為病毒數(shù)與待轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)之比值，也等于病毒效價(jià)×病毒液體積/待轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)，可理解為轉(zhuǎn)染一個(gè)細(xì)胞需要多少病毒數(shù)，理想的MOI值的確定應(yīng)當(dāng)是在轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性之間求的平衡。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BM-MSCs生長特點(diǎn)與免疫表型分析原代培養(yǎng)第5天的細(xì)胞可形成大小不等的細(xì)胞集落，細(xì)胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形態(tài)(見圖1A)。傳代48 h后細(xì)胞形成漩渦狀排列，呈典型的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征(見圖1B)。對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀免疫表型鑒定結(jié)果表明，分離純化的大鼠BM-MSCs高表達(dá) CD90和CD29，不表達(dá) CD45(見圖1C)。

2.2 Ad-VEGF165的擴(kuò)增及效價(jià)分析 轉(zhuǎn)染Ad-VEGF165的HEK293細(xì)胞光鏡出現(xiàn)細(xì)胞圓縮，細(xì)胞間隙變大的細(xì)胞損傷表現(xiàn);熒光顯微鏡下可見GFP的表達(dá)強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增強(qiáng)(見圖2)。收集擴(kuò)增的 Ad-VEGF165病毒液，從10－1到10－8按10倍梯度稀釋后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18 h后熒光顯微鏡下可見GFP充滿整個(gè)細(xì)胞輪廓，且GFP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)(熒光數(shù))隨稀釋倍數(shù)遞增而逐漸減少。計(jì)數(shù)所有孔中的熒光數(shù)，病毒稀釋度為10－7的孔板中熒光總數(shù)平均值為8(熒光數(shù)值為1～10)，根據(jù)病毒效價(jià)(pfu/ml)=(平均熒光數(shù)×10)/相應(yīng)稀釋度，計(jì)算擴(kuò)增制備的Ad-VEGF165病毒效價(jià)為8×108pfu/ml。

2.3 不同感染復(fù)數(shù)(MOI)Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染大鼠BM-MSCs的效果 轉(zhuǎn)染Ad-VEGF165后的BMMSCs仍可貼壁生長，并呈梭形或多角形，但細(xì)胞分裂增殖速度減緩。轉(zhuǎn)染24 h后可見細(xì)胞有GFP表達(dá)，但強(qiáng)度較弱;之后熒光漸增，并出現(xiàn)病毒毒性反應(yīng)，如細(xì)胞變圓或死亡等;96 h熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨后逐漸減弱，但病毒毒性漸強(qiáng)，細(xì)胞變圓或死亡增多(見圖3)。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明(見圖4A)，感染復(fù)數(shù)(MOI)為20和50組，Ad-VEGF對(duì) BM-MSCs生長與Ad-GFP組和PBS組比較無明顯差異，細(xì)胞活性無明顯降低(P＞0.05);MOI為100、200組，Ad-VEGF對(duì)BM-MSCs有明顯的生長抑制作用，程度與Ad-GFP組比較無明顯差異，但是與PBS組比較差異明顯，細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，MOI為50的Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs效率最高，達(dá)53.15%(見圖4B)。

圖1 大鼠BM-MSCs生長特點(diǎn)與免疫表型特征

圖2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h的顯微鏡所見(×100)

3 討論

盡管基因治療概念的提出已有20余年，但目前為止，全球范圍內(nèi)經(jīng)FDA批準(zhǔn)的基因治療策略和藥物仍寥寥無幾，原因在于合適的載體選擇、組織特異性定向轉(zhuǎn)染表達(dá)困難以及應(yīng)用安全性的擔(dān)憂。雖然存在上述種種障礙，但科學(xué)界一直未放棄基因治療的夢(mèng)想。近年來，隨著干細(xì)胞研究的不斷拓展，已有將基因治療與干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用的研究報(bào)道，初步證實(shí)了基因修飾干細(xì)胞移植這一新治療策略的可行性［6，7］。由于病毒與生俱來的感染性和對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用特點(diǎn)，是否可將病毒載體轉(zhuǎn)染目的基因到BM-MSCs，以實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞與基因治療的完美結(jié)合，值得深入研究。本文就體外VEGF基因腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BM-MSCs，并著重于對(duì)細(xì)胞的毒性作用、轉(zhuǎn)染效率、最佳病毒劑量等進(jìn)行研究，是探索這一新策略的前導(dǎo)性工作的有益探索。

重組腺病毒體外能高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染增殖和非增殖狀態(tài)的干細(xì)胞，但是病毒效價(jià)低于1×108pfu/ml時(shí)轉(zhuǎn)染效率低，即使增加病毒液體積，轉(zhuǎn)染效率提高也不明顯，且病毒毒性反應(yīng)加重［8，9］，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到類似現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)［10］報(bào)道的病毒效價(jià)計(jì)算方法，獲得擴(kuò)增的Ad-VEGF病毒效價(jià)為8×108pfu/ml，高于1×108pfu/ml，說明經(jīng)過本文擴(kuò)增體系獲得的病毒液可用于后續(xù)的干細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。本研究還通過臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測不同濃度Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs對(duì)其細(xì)胞活性的影響，并就Ad-VEGF轉(zhuǎn)染BM-MSCs的轉(zhuǎn)染率進(jìn)行分析，以探尋合理的病毒轉(zhuǎn)染濃度值(也即理想的感染復(fù)數(shù)值)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Ad-VEGF感染復(fù)數(shù)(MOI)大于50，BM-MSCs接觸到的Ad-VEGF病毒顆粒增多，病毒毒性作用增強(qiáng)，從而使BM-MSCs活性降低，生長受抑制，甚或大量細(xì)胞漂浮、死亡。當(dāng)加入Ad-VEGF病毒的MOI為50時(shí)，Ad-VEGF對(duì)BM-MSCs的毒性降低，BM-MSCs細(xì)胞活性和生長狀態(tài)良好，易于接受外源性基因，轉(zhuǎn)染效率也達(dá)到最高值53%的水平。

采用VEGF基因或含VEGF基因質(zhì)?；蛉毕菪韵俨《局苯幼⑸涞闹委煼椒?，因存在基因表達(dá)時(shí)間短，局部水腫明顯等問題，現(xiàn)已很少采用［11］。本實(shí)驗(yàn)采用Ad-VEGF成功轉(zhuǎn)染BM-MSCs，是將BMMSCs作為腺病毒介導(dǎo)基因治療平臺(tái)，不但可以減少進(jìn)入體內(nèi)的腺病毒劑量以及腺病毒與機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的直接接觸，有利于減輕腺病毒的毒性反應(yīng)，同時(shí)獲得高水平分泌 VEGF的轉(zhuǎn)基因 BMMSCs，在各種慢性缺血性疾病的治療中有望達(dá)到促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)雙重治療效果，具有良好的應(yīng)用前景。

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