李 娜 唐 艷 劉翠蘭 龍 達(dá)

（1 邵陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 邵陽(yáng) 422000；2 邵陽(yáng)市中心醫(yī)院內(nèi)二科，湖南 邵陽(yáng) 422000）

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要是環(huán)境因素與遺傳因素綜合作用的結(jié)果。而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子α等均與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系[1]。本研究旨在通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)VEGF及TNF-α在早期及進(jìn)展期大腸癌中的蛋白表達(dá)水平及相關(guān)性。從而研究其在大腸癌發(fā)病過(guò)程中的意義，為臨床治療及預(yù)后預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年1月至2010年12月在本院住院治療并經(jīng)腸鏡檢查及術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)的大腸癌患者80例。并選取同時(shí)期經(jīng)腸鏡及病理檢查證實(shí)結(jié)直腸正常的病例30例作為對(duì)照組。所有活檢標(biāo)本置于10%甲醛中固定，石蠟包埋后組織切片，厚度4μm左右用于免疫組化染色。兩組病例一般情況詳見(jiàn)表1。

1.2 免疫組化方法

DAB顯色試劑盒、鼠抗人VEGF多克隆抗體及羊抗人TNF-α均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。

免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：①陽(yáng)性細(xì)胞率：主要表達(dá)于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒狀染色為標(biāo)準(zhǔn)，且著色明顯高于背景或背景不著色而細(xì)胞著色為陽(yáng)性細(xì)胞。使用裝有目鏡網(wǎng)格測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡，在200倍視野下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)500～1000個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為陽(yáng)性細(xì)胞率。②表達(dá)強(qiáng)度：陰性（-）：細(xì)胞核/細(xì)胞漿內(nèi)未見(jiàn)顆粒狀染色；弱陽(yáng)性（+）：細(xì)胞核/細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于25%；陽(yáng)性（++）：細(xì)胞核/細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：細(xì)胞核/細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)深棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。實(shí)驗(yàn)中以PBS緩沖液代替一抗作為陰性空白對(duì)照。

表1 患者一般情況及腫瘤類型及分布情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF在大腸癌的表達(dá)情況

VEGF主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，少量表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于腸上皮細(xì)胞和腸腺之間的間質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)展期患者直腸黏膜中可見(jiàn)大量VEGF的表達(dá)，早期患者直腸黏膜可見(jiàn)部分VEGF表達(dá)，而對(duì)照組直腸黏膜中僅有少量或無(wú)VEGF表達(dá)。VEGF在早期大腸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率為（14/32，43.75%）；在進(jìn)展期大腸癌中表達(dá)陽(yáng)性率為（41/48，85.42%）；在對(duì)照組中表達(dá)陽(yáng)性率為（5/30，16.67%）。進(jìn)展期陽(yáng)性率明顯高于早期及對(duì)照組（P＜0.01），而早期大腸癌表達(dá)也高于對(duì)照組（P＜0.05）。

進(jìn)展期大腸癌VEGF的表達(dá)強(qiáng)度高于早期大腸癌組及對(duì)照組（P＜0.01），而早期大腸癌表達(dá)強(qiáng)度亦高于對(duì)照組（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 VEGF在早期及進(jìn)展期大腸癌及對(duì)照組中的表達(dá)強(qiáng)度情況

2.2 TNF-α在大腸癌的表達(dá)情況

TNF-α主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，少量表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于腸上皮細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞。進(jìn)展期及早期患者直腸黏膜中可見(jiàn)大量TNF-α的表達(dá)，而對(duì)照組直腸黏膜中僅有少量或無(wú)TNF-α表達(dá)。TNF-α在早期大腸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率為（24/32，75%）；在進(jìn)展期大腸癌中表達(dá)陽(yáng)性率為（40/48，83.33%）；在對(duì)照組中表達(dá)陽(yáng)性率為（7/30，23.33%）。進(jìn)展期及早期陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而早期大腸癌及進(jìn)展期腸癌間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

進(jìn)展期大腸癌TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組（P＜0.01），而早期大腸癌表達(dá)強(qiáng)度亦高于對(duì)照組（P＜0.01），但進(jìn)展期及早期大腸癌間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 TNF-α在早期及進(jìn)展期大腸癌及對(duì)照組中的表達(dá)強(qiáng)度情況

2.3 VEGF與TNF-α相關(guān)性

VEGF與TNF-α呈正相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.926，P＜0.01。

3 討 論

由于人們生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，大腸癌的發(fā)病率近年來(lái)逐漸升高，已經(jīng)成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，且大腸癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散，術(shù)后復(fù)發(fā)率一直較高[2-5]。因此近年來(lái)研究大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，試圖降低術(shù)后復(fù)發(fā)率一直是一個(gè)熱點(diǎn)。已有研究證明VEGF與TNF-α與腫瘤血管的形成密切相關(guān)，因此在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中也起著重要的作用[6-8]，但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)研究VEGF與TNF-α在大腸癌表達(dá)的較少。

VEGF作為一種已知的強(qiáng)促血管形成因子，在多種腫瘤中作為代謝及轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。本研究中，VEGF在早期大腸癌及進(jìn)展期腸癌中均有表達(dá)，而在對(duì)照組中，呈低表達(dá)。且在進(jìn)展期大腸癌中強(qiáng)烈表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率高達(dá)85.42%，且在腸黏膜中多呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這提示隨著腫瘤惡性程度的增加，VEGF的表達(dá)量也逐漸增加。說(shuō)明VEGF的表達(dá)量可以作為腫瘤惡性程度的標(biāo)志物。同時(shí)目前研究認(rèn)為由于惡性腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，組織增長(zhǎng)過(guò)快必會(huì)造成局部組織缺氧，從而誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而VEGF的表達(dá)也可間接反映腫瘤組織內(nèi)的缺氧狀態(tài)，用于判斷腫瘤對(duì)放化療藥物的敏感性[9]。多種腫瘤在放化療后均可表現(xiàn)VEGF的表達(dá)水平上調(diào)，如果拮抗VEGF的表達(dá)，可以增強(qiáng)放化療療效。在今后的研究中，我們希望能夠通過(guò)拮抗VEGF的表達(dá)，觀察對(duì)患者治療的影響。

而TNF-α是一種重要的抑癌基因，在多種腫瘤中廣泛存在，本研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌患者中，TNF-α表達(dá)明顯上升高于對(duì)照組，但在早期患者及進(jìn)展期患者中未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果提示TNF-α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，起著重要作用，但我們?nèi)孕钄U(kuò)大樣本進(jìn)一步研究，在早期大腸癌及進(jìn)展期大腸癌中TNF-α表達(dá)的差異。本研究中TNF-α及VEGF表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，有研究報(bào)道TNF-α可能通過(guò)FAK及NF-κB等作用于VEGF介導(dǎo)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移等生物行為，我們通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α，是否也可以起到抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲的作用也是我們下一步研究的重點(diǎn)。

總之，VEGF及TNF-α在大腸癌黏膜中表達(dá)增強(qiáng)，這兩個(gè)因子可以作為腫瘤惡性程度的標(biāo)志物，可能可以作為將來(lái)大腸癌新治療方式的靶點(diǎn)。

[1]Hoeben A,Aanduyt B,Highley MS,et al.Vascular endothelial growth factor and angiogenesis[J].Pharmacol Rev,2004,56(4):549-580.

[2]錢圖南.腫瘤放射治療學(xué)[M].3版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2002:772-775.

[3]Sasson AR,Mulcahy MF,Paty PB.Uptate in the management of Rectal[J].ASCO EDCR Cational Book,2006.

[4]Temple WJ,Saettler EB.Locally recurrent rectal cancer:role of composite resection of extensive pelvic tumors with strategies for minimizing risk of excurrence[J].J Surg Oncol,2000,73(1):47-58.

[5]莫善兢,劉瑛,許立功,等.現(xiàn)代腫瘤學(xué)[M].2版.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,2000:794-798.

[6]谷依學(xué),李漢賢,王漢群,等.TNF-α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào),2005,33(2):75-79.

[7]劉智紅,康楠.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與消化道腫瘤[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,20(1):145-146.

[8]王倩,陳曉理,劉力華.VEGF及其受體家族與白血病[J].中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué),2005,18(1):96-97.

[9]Marthinsen AB,Wanderas AD,Lundgren S,et al.Effects of growth factors on growth and radiation sensitivity of the human breast cancer cell line T-47D[J].Oncol Rep,2002,9(2):397-403.