周立遠 吳天清 張旭東 王家珍

（川北醫(yī)學院附屬三臺醫(yī)院 三臺縣人民醫(yī)院，四川 三臺 621100）

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）在Ca+信號通路中扮演一個重要的多功能調(diào)節(jié)因子[1]?？烧{(diào)節(jié)神經(jīng)介質(zhì)釋放神經(jīng)突觸的生長發(fā)育，與學習記憶和老年癡呆有關(guān)；在T細活化中起調(diào)節(jié)樞紐作用；在細胞凋亡中起中心環(huán)節(jié)作用，尤其是新近研究表明CaN-T細胞活化核因子（NF-AT3）途徑廣泛存在于心肌、血管平滑肌細胞等，CaN可參與維持心血管結(jié)構(gòu)和功能、抑制血管平滑肌細胞增殖、心肌細胞肥大，在心血管生理及病理生理過程中均發(fā)揮重要作用[2]。

CaN具有促進心臟血管生長及產(chǎn)生生理病理變化的作用，但CaN的作用效果跟年齡關(guān)系的研究較少。我們對不同年齡大鼠心臟和主動脈平滑肌組織的CaN活性測定，進一步證實它們在心血管中的組織分布差異性，觀察它們在機體衰老過程中隨年齡變化的趨勢，提供關(guān)于心血管老化的一些研究根據(jù)，并查找相關(guān)原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要實驗儀器：超低溫冰箱（USA）；高速離心機；UV-1100紫外-可見分光光度計；SN-695B型γ放射免疫計數(shù)儀；6531型電動攪拌機（勻漿機）；DHG-9070型恒溫干燥箱。

1.1.2 主要試劑及配制：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。該試劑盒有十一種試劑，其中定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。其他用品都是國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗動物：選購溫州研究所動物實驗中心的Wistar大鼠，隨機選擇1月年齡的大鼠12只、6月年齡的大鼠12只及24月年齡的大鼠12只，雌雄個體不再隨機分配，1月年齡的大鼠體質(zhì)量約為103.7g，6月年齡的大鼠體質(zhì)量約為230.1g，24月年齡的大鼠體質(zhì)量約為331.2g。把所購大鼠按年齡分為三組，即分為1月年齡組、6月年齡組和24月年齡組，并在各組內(nèi)分別隨機選擇12例健康大鼠，可命名為幼年組、青年組、老年組。

1.2 標本采集

1.2.1 在大鼠腹部注入50mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，立即剖開胸部，在右心室內(nèi)取出2mL血液，并將其放入抗凝試管內(nèi)，與由0.3M EDTA二鈉30μL、0.34M 8-羥基喹啉30μL及0.32M二硫基丙醇15μL組成的抑肽酶混合均勻，并在冰水中進行冷卻到4℃，1000r/min離心5min，最后把分離出來的血漿放入冰箱內(nèi)冷藏。

1.2.2 取出心臟血液后，應立即用生理鹽水把主動脈和心臟洗凈并放入液氮，然后取出剪碎，一半加入4倍體積的組織勻漿液（MOPS 0.1mol/L、pH 7.0、EDTA 2mmol/L、PMSF 75mg/L、trypsin in-hibitor 10mg/L、TPCK 10mg/L、leupeptin 1mg/L），在Polytron勻漿器上勻漿然后低溫離心機中（4℃）以14000r/min離心30min，上清即為組織提取液。少量用考馬斯亮藍法測定組織提取液中蛋白含量，其余作酶活性測定。

1.3 檢測指標

1.3.1 蛋白含量測定：考馬斯亮藍法測定心臟和主動脈平滑肌中CaN蛋白含量。

1.3.2 取組織勻漿上清液用生理鹽水按比例稀釋成2%組織勻漿液。

1.3.3 按表1操作。

表1 操作步驟

混勻，靜置10min，于595nm處，1cm光徑，UV-1100型分光光度計測定OD值。

1.3.4 蛋白含量計算：蛋白含量（g/L）=測定管OD值/標準管OD值×標準管濃度（g/L）。

1.4 CaN活性測定

試劑共11種，檢測時現(xiàn)配備1mmol/L標準磷貯備液和定磷劑然后按照說明操作。

CaN活性計算：規(guī)定每小時每毫克蛋白的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶分解底物PNPP產(chǎn)生1μmol/L無機磷的量為一個CaN活性單位。

公式：組織中CaN活力（nmol Pi/mg protein/hour）=（測定管OD值-對照管OD值）/（標準管OD值-標準空白管OD值）×標準管磷含量×反應體系中樣本稀釋倍數(shù)×3÷取樣量中蛋白毫克數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS13.0軟件，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用（±s）來表示。各組之間的差異運用單因素方差分析SNK法和t檢驗法來統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

不同月齡大鼠心肌及主動脈組織CaN的活性減檢測顯示：大鼠心肌與主動脈組織CaN活性隨月齡增大而降低，三組間相比差異有顯著性（P＜0.05），不同月齡大鼠心肌組織CaN活性比同月齡主動脈CaN活性高（P＜0.05）。不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測定結(jié)果見表2。

表2 不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測定結(jié)果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

表2 不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測定結(jié)果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

注：大鼠心肌CAN活性與1月齡組比較，◎P＜0.05；與6月齡比較，☆P＜0.05；主動脈CAN活性與1月齡組比較，○P＜0.05；與6月齡比較，◆P＜0.05；1月齡組間主動脈CAN活性與心肌CAN活性比較（★P＜0.05）；6月齡組間主動脈CAN活性與心肌CAN活性比較（▲P＜0.05）；24月齡組間主動脈CAN活性與心肌CAN活性比較（●P＜0.05）

1月齡組(n =12) 6月齡組(n =12) 24月齡組(n =12)心臟CaN活性 2.84±0.61 2.26±0.45◎ 1.58±0.38◎☆主動脈CaN活性 2.10±0.58★ 1.56±0.35○▲ 1.06±0.43●○◆

3 討 論

迄今為止，CaN為僅有的一類通過Ca2+/鈣調(diào)素（Calmodulin）在細胞內(nèi)進行信號傳遞調(diào)節(jié)酶類，這種酶是絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶在教科書中又被稱為蛋白磷酸酶2B，PP2B。CaN具有去磷酸化的效果，其重要的生理作用為通過多條信號傳導或利用去磷酸化的作用來調(diào)節(jié)其他信號傳導方式，從而起到調(diào)節(jié)Ca2+信號和其他第二信使聯(lián)合作用的效果，協(xié)同調(diào)節(jié)細胞的功能[3]。

心肌肥大可能為內(nèi)皮素、生長因子、血管緊張素Ⅱ等因素引起的肌肉肥大或心肌細胞對外部刺激的反應而變肥厚，也可能為先天性心臟缺陷所導致，其作用的共同特征都是引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。細胞內(nèi)Ca2+濃度升高或?qū)a2+的敏感性增強是心肌肥大發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而肥大基因的過度表達是各種病理刺激心肌肥大的共同分子機制。CaN作為唯一的Ca2+/CaM依賴的蛋白磷酸酶，其活性變化勢必受到血管平滑肌細胞Ca2+濃度的影響，從而激活終止或肥大信號過度表達[4]。很多研究觀察應用CsA處理后，心肌組織及血漿ANP含量分別下降了16%和14%。結(jié)果提示，CaN在壓力超荷性心肌肥大的信號傳遞中也可能起到重要作用[5]。

對不同年齡的大鼠腦中CaN含量與活力研究結(jié)果反映，CaN在大鼠腦發(fā)育時期含量與活力均呈有規(guī)律地變化，特別是在大鼠出生后2周左右，CaN含量與活力都顯著地升高。胎兒腦組織出生前4周內(nèi)增長較快；特別是出生后1周左右，CaN比活力達高峰，以后呈緩慢下降趨勢；至成人后則基本穩(wěn)定不再有較大的波動。正常雌性大鼠在性成熟前，生長發(fā)育速度很快，子宮平滑肌組織CaN的活性隨年齡增長逐漸增加，到性成熟后（16周后）穩(wěn)定在較高水平。

本實驗發(fā)現(xiàn)在大鼠的心肌和主動脈平滑肌組織中，心肌里的CaN的活性明顯比主動脈平滑肌組織高，這些可能與不同組織功能及發(fā)育早晚有關(guān)。心肌與血管平滑肌中CaN的活性隨著年齡的增長而增高，分析原因可能為心肌細胞內(nèi)鈣離子起著尤其重要的傳導作用，起著參與心肌做功及細胞能量代謝的生理功能，若能量代謝發(fā)生故障，便會因細胞內(nèi)清除鈣離子能力降低而導致細胞內(nèi)鈣離子的超負荷。鈣離子的超負荷會使線粒體受損，從而導致呼吸系統(tǒng)的障礙，引起能量減少，便會導致惡性循環(huán)的發(fā)生。因此本次調(diào)查結(jié)果為：鈣離子超負荷是引起缺氧后導致心肌細胞不可逆性損傷及細胞凋亡的重要原因[6]。Ca2+超負荷的程度越高，則心肌細胞功能的影響也就越大[7]。CaN在出生后在其含量維持在一定的水平上，對心血管組織發(fā)育，功能維持發(fā)揮重要作用，但同時隨著年齡的增長，心血管系統(tǒng)中受體的下調(diào)以及其他相關(guān)酶系統(tǒng)活性的降低，CaN的活性也是降低。從實驗結(jié)果看出在心肌與主動脈該CaN隨著年齡的增加其活性是逐漸下降的。CaN活性年齡增加而降低。它們的組織分布差異性與年齡的變化特點，為心血管老化研究提供新的思路。

[1]Klee CB,Cohen P.The calmodulin-regulated protein phosphatase molecular aspects of cellular regulation[M].Amsterdam:Elservier Science,1999:456.

[2]顏偉,盧才義.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路與心房纖顫相關(guān)性研究進展[J].實用醫(yī)藥雜志,2007,24(6):744-745.

[3]Guerini D.Calcineurin,not just a simple protein phosphatase[J].Biochem Bio Phys Res Commun,1997,235(2):271-275.

[4]張榮成,王萌萌,王建春.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在心肌肥厚中的作用[J].心血管病學進展,2007,28(2):321-324.

[5]姚泰.生理學[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:45.

[6]邱麗穎,王德寶.不同年齡大鼠平滑肌Ca2+/CaM-PP活性特點[J].張家口醫(yī)學院學報,1999,16(3):1-2.

[7]劉遂心,孫明,李彤.薯蕷皂甙對缺氧心肌細胞的保護作用研究[J].中國全科醫(yī)學雜志,2004,7(4):40-41.