劉丹 汪涯雅 黃振倩

結(jié)腸癌是常見惡性腫瘤之一，晚期結(jié)腸癌預(yù)后差，Dukes C期的 5年生存率只有30%~60%，而Duckes D期的5年生存率更低至<5%，重要原因在于腫瘤生長早期即可通過局部浸潤、侵襲淋巴管或毛細(xì)血管等方式向遠(yuǎn)處播散轉(zhuǎn)移，腫瘤的免疫逃逸造成機(jī)體免疫系統(tǒng)無法正確識別、清除播散的腫瘤細(xì)胞，癌細(xì)胞聚集生長并誘導(dǎo)毛細(xì)血管增生，最終在肝臟、肺、前列腺及骨等臟器發(fā)展形成轉(zhuǎn)移灶。研究證明機(jī)體內(nèi)存在著完善的抗腫瘤免疫監(jiān)視系統(tǒng)和抗腫瘤免疫應(yīng)答。與此同時，腫瘤細(xì)胞也進(jìn)化出了一系列機(jī)制逃避宿主的免疫監(jiān)視和攻擊，如共刺激分子表達(dá)缺陷，分泌可溶性免疫抑制物質(zhì)等，這就是腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。FAS（APO-1/CD95）與FASL（Fasligand）屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族，為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，其相互作用可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Apoptosis），從而維持機(jī)體發(fā)育和自身穩(wěn)定所必需的細(xì)胞生理性死亡。該系統(tǒng)同時也是機(jī)體抗腫瘤免疫的重要組成部分。FAS抗原高表達(dá)于機(jī)體正常細(xì)胞表面，常見腫瘤如消化道腫瘤、肺癌、乳腺癌，均表現(xiàn)為低表達(dá)FAS抗原，而高表達(dá)FASL抗原。Greeneltch等[1]和Wajant等[2]研究證實腫瘤細(xì)胞借助過表達(dá)的FasL，通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)抗腫瘤活性淋巴細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞周圍的腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞（CTL）、自然殺傷細(xì)胞（NK）以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL），從而逃避機(jī)體的免疫識別和免疫攻擊。

本研究構(gòu)建RNA干擾分子載體轉(zhuǎn)染Balb/c小鼠淋巴細(xì)胞，降低腫瘤特異性淋巴細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)。采用同種異體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察不同實驗組中淋巴細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用的耐受狀況，探討通過阻斷FAS表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)的抗腫瘤淋巴細(xì)胞凋亡作用及其在抗腫瘤免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) Bab/c小鼠脾淋巴細(xì)胞株及小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株（CT26）由暨南大學(xué)李偉教授惠贈。細(xì)胞株置于含10%BSA，100 u/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RMPI1640培養(yǎng)液中，于5% CO2，37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 分子載體構(gòu)建 根 據(jù)NCBI GenBank中小鼠Fas基因cDNA序列（序列號：NM_007987，按照siRNA序列設(shè)計原則，利用Ambion公司設(shè)計軟件，選擇2個靶位點設(shè) 計兩對共四條60bp左右大小的DNA片段，靶位點為716bp-736bp和782bp-802bp，序列如下：第一對正鏈：5’-GATCCATAC ATCCCGAGAATTGCTTTCAAGAGAAGCAATTCTCGGGATGTAT TTTTTTGGAAA-3’；負(fù)鏈：5’-AGCTTTTCCAAAAAAATACAT CCCGAGAATTGCTTCTCTTGAAAGCAATTCTCGGGATGTATG-3’。第二對正鏈：5’-GATCCGCATCAAGGAGGGCAAGATATT CAAGAGATATCTTGCCCTCCTTGATGTTTTTTGGAAA-3’；負(fù)鏈：5’-AGCTTTTCCAAAAAACATCAAGGAGGGCAAGATAT CTCTTGAATATCTTGCCCTCCTTGATGCG-3’。由上海恒新公司合成引物并克隆至表達(dá)載體pSilencer3.0中，即構(gòu)建成Fas基因dsRNA分子表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建完畢后轉(zhuǎn)化受體菌，篩選鑒定挑選表達(dá)效率較高組作為研究工具。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 制備的分子載體采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，在培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。在鏡下觀察真核表達(dá)質(zhì)粒中增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況并計算轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實驗分組 取對數(shù)生長期的小鼠淋巴細(xì)胞105置于培養(yǎng)板中，根據(jù)研究需要將其分為3個組：（1）實驗組：轉(zhuǎn)染研究用質(zhì)粒。（2）陰性對照組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。（3）空白對照組：不做任何轉(zhuǎn)染。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組淋巴細(xì)胞FAS/FASL表達(dá)水平FITC標(biāo)記兔抗鼠CD95（FAS）抗體及CD174（FASL）購自上海瑞齊生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)10 d后經(jīng)胰酶消化，離心收集制成細(xì)胞懸液，PBS液洗滌后加入分別上述抗體，4 ℃孵育30 min后以流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）檢測FAS/FASL表達(dá)。

1.6 同種異體混合淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗 取轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期CT26細(xì)胞接種至6孔板，調(diào)整細(xì)胞數(shù)約5×104/孔。隨后按細(xì)胞數(shù)5:1比例取不同組對數(shù)生長期淋巴細(xì)胞與CT26細(xì)胞共培養(yǎng)，72 h后達(dá)到檢測條件。

1.7 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法檢測各組淋巴細(xì)胞增殖生長情況 以生理鹽水制備終濃度為5 mg/ml的MTT溶液，胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整其濃度至（5~10）×104/ml，接種至96孔培養(yǎng)板，5% CO2，37 ℃孵育48 h。每孔加入 10 μl MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時期各組淋巴細(xì)胞表達(dá)FAS/FASL抗原情況 在細(xì)胞培養(yǎng)+15 d分別取各組淋巴細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并以FITC標(biāo)記的CD95（FAS）抗體及CD174（FASL）抗體孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面FAS、FASL表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RNA干擾分子載體實驗組淋巴細(xì)胞表面FAS（CD95）表達(dá)水平明顯下降，與陰性對照組及空白對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05或P<0.01），證實實驗組淋巴細(xì)胞FAS抗原表達(dá)被RNA干擾載體抑制。FASL（CD174）表達(dá)陽性率與陰性對照組及空白對照組間無明顯差異（P>0.05）。陰性對照組與空白對照組間FAS、FASL表達(dá)率無明顯差異（P>0.05）。見表1、圖1。

表1 各組淋巴細(xì)胞表面FAS、FASL表達(dá)陽性率分析

圖1 各組淋巴細(xì)胞表面FAS、FASL表達(dá)陽性率

2.2 MTT法檢測各組淋巴細(xì)胞生長情況 在細(xì)胞培養(yǎng)+5 d、+10 d、+15 d、+20 d分別取各組淋巴細(xì)胞經(jīng)MTT比色法檢測其吸光度值（OD），分析細(xì)胞生長增殖情況。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RNA干擾分子載體實驗組淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)至+10 d以后其增殖速度明顯快于陰性對照組（僅轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒）及空白對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）。+15 d及+20 d監(jiān)測OD值與陰性對照組及空白對照組比較差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），陰性對照組與空白對照組間細(xì)胞增殖速度無明顯差異。見表2、圖2。

表2 各組淋巴細(xì)胞在各時間點吸光度測量值（s）

表2 各組淋巴細(xì)胞在各時間點吸光度測量值（s）

*與陰性對照組及空白對照組比較，P<0.05；△與陰性對照組及空白對照組比較，P<0.01

實驗組 1.40±0.15 2.89±0.24 5.60±1.41*10.17±2.53*△陰性對照組 1.29±0.27 1.80±0.64 3.21±0.72 5.16±1.03空白對照組 1.24±0.13 1.38±0.39 2.19±0.95 4.29±1.69

圖2 各組CT26細(xì)胞的生長曲線

3 討論

Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，它既是機(jī)體重要的抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制，也是腫瘤細(xì)胞誘發(fā)免疫逃逸的重要作用位點。目前關(guān)于Fas/FasL系統(tǒng)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系的研究主要集中于評價腫瘤細(xì)胞Fas抗原表達(dá)的下降和（或）FasL表達(dá)的增加在免疫逃逸中的地位和作用以及參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制。目前認(rèn)為Fas/FasL系統(tǒng)是結(jié)腸腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視或免疫殺傷的主要機(jī)制。Petak等[3]報道發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織可通過Fas基因突變來改變Fas啟動凋亡的傳遞途徑和干擾凋亡信號的傳導(dǎo)，降低結(jié)腸癌細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞FasL的敏感性，可能的機(jī)制：（1）凋亡抑制基因的高表達(dá)，如bcl-2和FAP-1。（2）血清sFasL（soluable Fas）水平升高，sFas區(qū)別于Fas之處在于，sFas分子跨膜區(qū)有363個bp缺失，使sFas分子跨膜區(qū)的17個氨基酸和膜外區(qū)5個氨基酸丟失，由于翻譯產(chǎn)物缺乏跨膜區(qū)而呈可溶性分泌，結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的sFas 與淋巴細(xì)胞表面的FasL結(jié)合可競爭性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞表面的FasL結(jié)合，通過此途徑抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。（3）產(chǎn)生FADD樣的FLICE的抑制蛋白（FKIP）。（4）凋亡抑制因子家族成員上調(diào)。Fas基因改變導(dǎo)致Fas表達(dá)下調(diào)，使Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能喪失，從而阻止結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。Song等[4]報道證實結(jié)腸腫瘤患者外周血存在高濃度、高效價的可溶性FasL（sFasL）分子，參與對結(jié)腸腫瘤患者全身免疫系統(tǒng)的抑制作用和組織損傷過程。該研究證實結(jié)腸腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)時產(chǎn)生和釋放sFasL可使表達(dá)Fas抗原的細(xì)胞凋亡，也可以誘導(dǎo)激活T細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞更易增殖并轉(zhuǎn)移。今年來的文獻(xiàn)報道抗FAS單克隆抗體（CH11）在結(jié)腸癌、乳腺癌、急性白血病等多種腫瘤的體外實驗中已經(jīng)被證實能夠有效降低細(xì)胞膜FAS水平[5-6]，可以明顯抑制腫瘤特異性免疫細(xì)胞的凋亡[7]，本次研究證實以RNA干擾技術(shù)沉默淋巴細(xì)胞FAS基因表達(dá)，可以明顯減少細(xì)胞膜FAS抗原表達(dá)，從而封閉結(jié)腸癌細(xì)胞通過FAS/FASL對淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，為抗腫瘤免疫效應(yīng)研究提供了有價值的實驗資料，并可為結(jié)腸腫瘤的生物治療提供新的技術(shù)途徑。

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