王 茜

（江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院· 215300）

缺血性腦中風是臨床上最常見的腦血管病之一，具有致死率高和致殘率高的特點，其發(fā)病率隨年齡的增長呈直線上升趨勢。探索一種既可以最大限度地減少醫(yī)源性風險又能有效地保護大腦的藥物是當今醫(yī)療界所面臨的重要課題。中藥四物湯由白芍、當歸、川芎和地黃組成，用于婦科疾病、癰疽、慢性炎癥的治療。實驗表明四物湯能增強血清超氧化物歧化酶活力，促進自由基消除，同時具有抗輻射、抗突變及調節(jié)內分泌等作用[1]。關于它是否具有保護大鼠對抗腦缺血再灌注損傷的作用未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠共60只，清潔級，體重200～240g；由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器

栓線（北京沙東生物科技有限公司），TTC(美國Sigma公司)，水合氯醛（國藥集團），生理鹽水注射液（民生藥業(yè)），電子天平（AG285，梅特勒-托利多，德國），電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型制備

按實驗設計隨機分組，動物用10%水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，在近心端結扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始計算距離，當插入深度約18mm時，記錄栓線插入的時間，同時緊緊系牢CCA遠心端的細線，縫合傷口，整個手術過程采用恒溫系統(tǒng)維持動物體溫在37℃。插入栓線2h后輕輕地將栓線拔出10mm左右從而實現(xiàn)腦缺血后的再灌注。實驗結束后，大鼠常溫分籠飼養(yǎng)。

1.4 藥物來源及給藥方案

四物湯由本院提供。經(jīng)生理鹽水稀釋后，于大鼠腦缺血發(fā)生前4h灌胃給藥，本方案共分為5組，分別為假手術組、生理鹽水組、100mg/kg組、200mg/kg組及300mg/kg組。其中四物湯給藥組生藥量終濃度分別為1，2，4g/L，給藥體積均為1mL，其中生理鹽水組給予等體積的生理鹽水溶液。

1.5 腦相對梗死體積評測

大鼠缺血后24h，水合氯醛麻醉處死，斷頭取腦，除去小腦和低位腦干、嗅球，將剩余腦組織沿冠狀面切成5片，每片厚2mm，腦片置于2%的TTC溶液中37℃避光孵育30min。正常的腦組織染成紅色，梗死組織成白色。拍照，用圖像分析軟件ImagePro-Plus4.5測量并計算各組大鼠梗死面積，然后用下述公式計算相對梗死體積以排除腦水腫對統(tǒng)計造成的誤差[2]。

相對梗死體積(%)=（未損傷測大腦總體積-損傷測未梗死體積）/未損傷測大鼠腦總體積×100%

1.6 大鼠神經(jīng)學功能評分

分別于缺血后6h及24h按照Bederson5分制評分，采用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向右側轉圈；3分：向右側顛倒；4分：不能自發(fā)行走，甚至意識消失。

1.7 腦水含量測定:

于缺血24h后斷頭取腦, 將左右腦分別置于預先稱重的試管中, 以電子天平( 分度值為0.1mg)稱取重量, 然后放入95℃ 恒溫烘干箱中烘烤24小時至恒重, 再次稱重后, 按下述公式計算腦水含量: 腦水含量(% )=( 濕重- 干重)/濕重×100%

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計，使用SPSS 17.0 進行Tukey或Scheffe組間分析，組間神經(jīng)功能評分采用秩和檢驗，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 四物湯能減少缺血大鼠的腦相對梗死體積

為了探討四物湯對缺血性腦中風的潛在治療作用，大鼠缺血前4h通過灌胃給予不同劑量的四物湯。再灌注24h結束后，取腦進行TTC染色（圖1）。紅色部分代表未梗死區(qū)域，白色部分代表梗死區(qū)域。通過對腦梗死體積統(tǒng)計分析，結果顯示， 200mg/kg及400mg/kg四物湯治療組的相對梗死體積顯著地小于生理鹽組（*P＜0.05、**P＜0.01 vs 生理鹽水組，n=7）。

圖1 四物湯對大鼠腦梗死體積的影響

2.2 四物湯能減輕大鼠缺血所致的神經(jīng)功能損傷

為了觀察四物湯治療對大鼠神經(jīng)功能評分的影響，于給藥后24h，按照上述方法對大鼠進行神經(jīng)功能評分，并采用秩和檢驗分析組間差異。結果顯示，僅400mg/kg四物湯治療能顯著地改善大鼠神經(jīng)功能（**P＜0.01 vs生理鹽水組，n=7）（圖2）。

圖2 四物湯對大鼠神經(jīng)功能的影響

2.3 四物湯能夠減少缺血大鼠的相對腦水含量

在臨床上防治腦水腫是治療腦缺血過程中的一項重要治療原則。而腦水含量的變化直接反映腦水腫的程度。因此，我們選取腦水含量來考察四物湯對腦缺血再灌注損傷的保護作用。結果顯示，200mg/kg及400mg/kg四物湯治療組能夠顯著地減少減少缺血大鼠的相對腦水含量（**P＜0.01 vs 生理鹽水組，n=5）（圖3）

圖3 四物湯對大鼠相對腦水含量的影響

3 結論與討論

本研究考察了不同劑量的四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，研究結果顯示，當大鼠腦缺血前經(jīng)灌胃給予一定劑量四物湯治療能夠明顯減輕缺血再灌注誘導的腦損傷，并且該保護作用呈劑量依賴性。四物湯治療顯著地縮小了腦梗死體積，減輕了神經(jīng)功能的損傷并減輕了腦水腫。該結果為研究開發(fā)治療缺血性腦中風的藥物提供了可能。眾所周知，過量的自由基損傷是造成腦缺血特別是再灌注時期大鼠腦損傷重要機制之一。文獻顯示，四物湯具有一定的清除自由基損傷的作用，該作用可能是四物湯發(fā)揮上述保護作用的機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，當歸作為四物湯中重要組分，其有效成分當歸內酯能減少局灶性的腦缺血損傷[3]。此外，當歸和川芎中有效成分藁本內酯具有良好的改善微循環(huán)作用,可用于防治與微循環(huán)障礙有關的疾病[4]。以上機制只是結合已有研究所做猜測，其確切的保護作用機制有待進一步研究。

[1]張榮桃. 四物湯的現(xiàn)代研究進展[J].北京中醫(yī)藥,2012,31(1):73-75

[2]Joshi CN, Jain SK, Murthy PSR ( 2004). An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Brain Research Protocols 13(1): 11-17.

[3]張光毅,杜俊蓉,曠喜等. 當歸內酯治療大鼠局灶性腦缺血的作用機制[J]. 華西藥學雜志.2006 ,21(2):114-117

[4]汪程遠,杜俊蓉,錢忠明.藳本內酯研究進展[J]. 中國藥學雜志,2006, 41(12):889-890