任鳳梧 海景歌 路瑞華 曹 蕊 蔣曉野

（黑龍江省中醫(yī)研究院·150036）

病毒性心肌炎(virus myocarditis,VMC)是臨床較為常見的心血管疾病之一,多發(fā)于青少年，心功能下降是病毒性心肌炎重要的病理生理特征。病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確,病毒對心肌的直接損害和機(jī)體免疫反應(yīng)介導(dǎo)被認(rèn)為是病毒性心肌炎的主要發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究旨在利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察心樂膠囊對病毒性心肌炎模型小鼠心肌組織Bcl-2蛋白及Bax蛋白水平的影響，從細(xì)胞組織學(xué)的角度，探討心樂膠囊抗心肌損傷的作用機(jī)制，以更好地應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c雄性小鼠，3周齡，體重10±2克，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SYXK（黑）2008004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

心樂膠囊：黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室提供；功效：益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀；主治：病毒性心肌炎；批號：黑藥制字（2010）Z20100005。玉丹榮心丸：上海玉丹藥物有限公司生產(chǎn)；功效：益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱解毒、強(qiáng)心復(fù)脈；主治：病毒性心肌炎、疑似性心肌炎、各類病因所致心肌損傷。批號：Z10970095

1.3 造模用病毒

柯薩奇病毒B3型(CVB3),Nancy株,引自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)中心。在Hela細(xì)胞上傳代，凍融3次，以3000r/min離心，取上清液測得病毒半數(shù)組織感染率（TCID50），分裝后于-30℃保存。

1.4 建立病毒性心肌炎小鼠模型

小鼠腹壁常規(guī)碘酒、酒精消毒后，于腹中線偏右0.5cm-1.0cm處向后上方進(jìn)針(5號半針頭)，針頭與皮膚夾角為450，有落空感后回抽針管，無回血后，給予500 TCID50CVB3稀釋液0.2ml腹腔注射即可。每隔四天注射一次,即分別在0d、5d、10d、15d注射，建立病毒性心肌炎小鼠模型。

1.5 藥物劑量選擇及給藥途徑

空白對照組：腹腔內(nèi)注射等容量的生理鹽水0.2ml。模型對照組：腹腔內(nèi)注射0.1ml/10gCVB3建立病毒性心肌炎小鼠模型。陽性對照組：造模成功后，按3.51g/kg.d給予濃度為70.2%玉丹榮心丸混懸液0.2ml，進(jìn)行灌胃，每日一次，連續(xù)14天。心樂膠囊高中低劑量組：造模成功后,分別按2.184g/kg、1.092g/kg、0.546g/kg給予心樂膠囊混懸液0.2ml進(jìn)行灌胃，每日一次，連續(xù)14天。以上藥物均用蒸餾水定期配制，配制后儲存于4℃冰箱中。日1次灌胃。

1.6 觀察指標(biāo)

免疫組織化學(xué)檢查 分別于7天、14天每組取15只小鼠，取部分心肌組織4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,采用SABC 法,每例切片各取4張分別作Bcl- 2 和Bax測定。顯微鏡觀察,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為免疫組化染色陽性細(xì)胞。免疫組化定量分析:采用Motic BA400計算機(jī)圖像分析系統(tǒng),將切片通過光學(xué)顯微鏡放大400倍,攝取圖像輸入分析系統(tǒng)內(nèi),進(jìn)行圖像灰度變換, 使染色陽性面積與背影分開, 并自動測量。每張切片隨機(jī)選5個視野,5個視野測試面積作為包容空間(或稱參考空間),將Bcl-2、Bax的陽性面積除以包容空間, 取其均值作為“陽性區(qū)域面積”。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差x±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

免疫組化染色陽性信號位于細(xì)胞漿，胞漿呈棕黃色。Bcl-2及Bax表達(dá)的陽性細(xì)胞主要見于心肌細(xì)胞,呈散在或簇狀分布。小鼠心肌在第7天、第14天各組Bcl-2和Bax的表達(dá)情況見表1、2?？瞻捉M小鼠心肌細(xì)胞有一定的Bcl-2及Bax表達(dá)。除空白對照組外，其它組Bcl-2蛋白的表達(dá)在第7天時均達(dá)到最高峰,此后表達(dá)開始逐漸下降,到第14天時降至相對較低水平，Bax表達(dá)均降低。在第7天時，與模型組相比，心樂膠囊各組和陽性藥組可使Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，有顯著差異（P＜0.01）, Bax表達(dá)下降。與陽性藥組相比，心樂膠囊各劑量組均可使小鼠心肌組織Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，有顯著差異，其中以心樂膠囊高劑量組最為明顯（P＜0.01）。降低Bax表達(dá)下降程度，陽性藥組和心樂膠囊各組無差異。在第14天Bcl-2蛋白的表達(dá)，與陽性藥組相比，心樂膠囊各劑量組均可使小鼠心肌組織Bcl-2蛋白的表達(dá)仍較高，有顯著差異（P＜0.05）其中以心樂膠囊高劑量組最為明顯。Bax表達(dá)下降，各組之間無顯著差異。

表1 第7天小鼠心肌Bcl-2、Bax表達(dá)水平

表2 第14天小鼠心肌Bcl-2、Bax表達(dá)水平

3 討論

VMC是由病毒感染引起的彌漫性或局限性心肌炎性病變,是較為常見的心血管疾病。目前認(rèn)為,病毒直接損傷作用及免疫機(jī)制均參與VMC的致病,最近的研究表明,在VMC的發(fā)生發(fā)展過程中某些信號通路、柯薩奇病毒腺病毒受體[1]及細(xì)胞凋亡也起著重要作用。近年發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bax是一對與細(xì)胞凋亡最為密切的凋亡相關(guān)分子, 在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著十分重要的作用[2]。細(xì)胞凋亡是一種由遺傳基因控制的生理性細(xì)胞主動死亡,它貫穿于機(jī)體的整個生命過程中,維持組織器官正常生理功能及細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。CVB3感染后，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)Bcl-2,其將對心肌具保護(hù)作用。CVB3感染心肌后,可促使心肌過量表達(dá)Bax,誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[3]。心樂膠囊是國家名郭文勤教授從臨床醫(yī)學(xué)實(shí)際出發(fā)，創(chuàng)造性地運(yùn)用中醫(yī)理論探討病毒性心肌炎的病機(jī)與治則，以益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、養(yǎng)血安神為法，成功地研制出的經(jīng)驗(yàn)方。廣泛的應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)顯示，病毒感染小鼠后，心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)上升，但以心樂膠囊高劑量組升高最明顯，降低Bax表達(dá)水平，也以心樂膠囊高劑量組最明顯。說明心樂膠囊可以減少細(xì)胞凋亡對心肌的損傷作用，通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax平衡而起到抗心肌損傷的作用，促進(jìn)疾病的轉(zhuǎn)歸。且通過觀察，心樂膠囊可以改善病毒性心肌炎小鼠生活質(zhì)量，明顯減少死亡率，而無明顯副作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了心樂膠囊對病毒性心肌炎的細(xì)胞凋亡因子的作用，為該藥應(yīng)用于臨床及其它層面作用機(jī)理的探詢提供了部分依據(jù)。

[1]李芳,易豈建.黃芪對病毒性心肌炎小鼠心臟柯薩奇病毒和腺病毒受體表達(dá)的影響[J].臨床心血管病雜志,2007,23(3):195-197

[2]Crow MT, Mani K, Kitsis RN. T he mitochondrial death pathway and cardiac myo cyte apoptosis. Circ Res 2004;95( 10)957-970

[3]韓 波,馬沛然,韓秀珍,等.Bcl-2和Bax基因產(chǎn)物在小鼠柯薩奇病毒性心肌炎心肌組織中的表達(dá)[J].實(shí)用兒科臨床雜志ShiyongErke Linchuang Zazhi,2003,18(7):513-515