楊吉榮 王蕊娜 武 華

1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，山西太原 030001；2.山東協(xié)和學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001

重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床上一種常見的急腹癥，病 情險惡，死亡率高，不僅表現(xiàn)為胰腺局部的病理損傷，而且常常涉及明顯的全身炎癥反應(yīng)及并發(fā)多器官損傷。腸屏障功能受損后引發(fā)的腸道細(xì)菌易位是其繼發(fā)感染和膿毒癥的主要原因[1]。研究證實(shí)多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放是造成腸道屏障損傷、腸道通透性增加和腸源性感染的原因。復(fù)合膳食纖維（DFC）是不易被消化的食物營養(yǎng)素，能清腸通便，幫助消化，減輕受損腸黏膜的損害，改善腸黏膜的微生態(tài)，促進(jìn)腸道功能的恢復(fù)，保護(hù)腸黏膜屏障。本實(shí)驗通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，探討復(fù)合膳食纖維（DFC）對腸屏障功能的影響，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物與試劑

健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重200～220 g。瑞素（腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑）、膳食纖維（包括可溶性和不可溶性膳食纖維）由華瑞制藥有限公司提供。occludin、ZO-1以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型的建立

采用胰膽管逆行注射法復(fù)制SAP模型。Wistar大鼠造模前自由飲水，禁食24 h，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/100 g）麻醉。采用腹部正中切口打開腹腔，近十二指腸乳頭開口處用無創(chuàng)血管夾夾閉胰膽管，距左右肝管匯合處1 cm處用1 mL注射器穿刺胰膽管，并在該部位用無創(chuàng)血管鉗夾閉胰膽管防止逆流，緩慢推注5%的牛黃膽酸鈉（0.1mL/100 g）。遠(yuǎn)近端夾閉胰膽管10 min[2]?？p合十二指腸穿刺孔?？梢娨认俳M織充血、水腫，繼而可見包膜下胰腺組織點(diǎn)狀或小片狀出血?？漳c營養(yǎng)管：經(jīng)胃幽門區(qū)，避開血管豐富區(qū)，先用粗針戳一破口，然后置入一外徑1.5 mm硅膠管至空腸，于胃壁處縫合固定，經(jīng)皮下隧道將其自頸部引出，固定于頸部皮膚后關(guān)腹[3]。術(shù)后隨機(jī)抽樣解剖證實(shí)為急性重癥胰腺炎。

1.3 實(shí)驗分組

將SAP大鼠隨機(jī)分為三組：SAP+腸內(nèi)營養(yǎng)乳劑 （瑞素）組（A組），SAP+瑞素加復(fù)合膳食纖維（20 g/L）1組（可溶性膳食纖維 SDF∶不可溶性膳食纖維 IDF=2∶1，B 組），SAP+瑞素加膳食纖維（20 g/L）2 組（SDF∶IDF=1∶2，C 組）。 術(shù)后 6 h 開始給予腸內(nèi)營養(yǎng)，通過注射器按125 mL/（kg·d）分四次給予不同的腸內(nèi)營養(yǎng)制劑。每組20只，飼養(yǎng)期間自由飲用生理鹽水。

1.4 檢測指標(biāo)

于術(shù)后48 h每組20只大鼠開腹，距回盲部5 cm處取小腸組織10 cm，并與取材后采用頸椎脫臼法處死相應(yīng)大鼠。所取小腸組織用10%甲醛溶液固定并制成石蠟切片。

1.4.1 小腸組織損傷評估 參考Chiu評分法評估小腸腸黏膜損傷程度[4]。行蘇木精-伊紅染色采用雙盲法在光鏡下觀察組織損傷程度。

1.4.2 oc cl udi n、ZO-1與MLCK的表達(dá) 采用常規(guī)SP法測定后DAB顯色，實(shí)驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗，同法進(jìn)行染色。滴入occludin抗體（1∶200），ZO-1 抗體（1∶200），MLCK 抗體（1∶1 000），每一種切片隨機(jī)選卻染色清晰者5～8張，于光鏡下（40×）隨機(jī)選取3個視野，并在高倍鏡下（200×）觀察陽性顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布。免疫染色的結(jié)果判斷：一個半定量模式，由兩個獨(dú)立的無臨床知識的觀察者進(jìn)行染色評分。細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。＞75%的細(xì)胞染色判為（+++），51%～75%染色為（++），10%～50%染色為（+），＜10%染色為陰性[5]。所有實(shí)驗均重復(fù)3次，以保證可重復(fù)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料采用精確概率法，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療后三組大鼠小腸組織損傷評分比較

B組與C組大鼠的腸黏膜損傷相對于A組較輕，C組大鼠的腸黏膜損傷相對于B組較輕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療后三組大鼠小腸組織損傷評分比較見表1。

表1 腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療后三組大鼠腸黏膜病理Chiu評分（x±s，分）

2.2 三組小腸黏膜occludin、ZO-1、MLCK蛋白的表達(dá)

腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療的B組與C組大鼠的腸黏膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1和MLCK的分布表達(dá)相對于A組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且C組occludin及ZO-1的分布和表達(dá)高于B組（P＜0.05）。C組MLCK的分布和表達(dá)高于B組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2～4。

表2 小腸黏膜occludin蛋白的表達(dá)（例）

表3 小腸黏膜ZO-1蛋白的表達(dá)（例）

表4 小腸黏膜 MLCK蛋白的表達(dá)（例）

3 討論

腸道上皮細(xì)胞的緊密連接狀況直接反映其屏障功能。細(xì)胞緊密連接蛋白主要存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中，使相鄰細(xì)胞膜緊密靠在一起，形成環(huán)繞細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)。閉鎖蛋白o(hù)ccludin是封閉相鄰上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞之間間隙的重要成分，與質(zhì)膜下蛋白密切相關(guān)共同維護(hù)緊密連接的屏障功能。ZO-1起著TJ形成的裝配平臺作用，它將閉鎖蛋白和細(xì)胞骨架系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)[6]。MLCK屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶家族，在Ca2+和鈣調(diào)蛋白存在下，MLCK對肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進(jìn)行磷酸化作用，并促進(jìn)肌球蛋白與肌動蛋白絲間相互作用[7]，誘導(dǎo)連接周圍的肌動蛋白和肌球蛋白絲收縮，對緊密連接和細(xì)胞表面產(chǎn)生張力，開放緊密連接[8]。通過使用肌動蛋白解聚劑能開放細(xì)胞間緊密連接[9]。在MLCK與腸黏膜屏障關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，由肌球蛋白Ⅱ調(diào)控的輕鏈的磷酸化引起的細(xì)胞骨架的收縮是腸上皮屏障破壞的必要因素[10]。

膳食纖維（DF）是指來源于植物，不被小腸中消化酶水解的多糖和極少量木質(zhì)素的總和，主要為纖維素、半纖維素與果膠類物質(zhì)，包括可溶性膳食纖維（SDF）和不可溶性膳食纖維 （IDF），SDF在上段腸腔不被消化吸收并在結(jié)腸被分解為短鏈脂肪酸（SCAF），可防止腹瀉，維持和刺激腸道細(xì)胞的形態(tài)和功能。IDF具有促進(jìn)腸蠕動，減少有毒物質(zhì)與腸黏膜的接觸時間，減少蛋白發(fā)酵產(chǎn)生毒物。二者共同保護(hù)腸黏膜屏障。本實(shí)驗表明，含膳食纖維的瑞素腸內(nèi)營養(yǎng)組較單純?nèi)鹚啬c內(nèi)營養(yǎng)組腸黏膜病理改變輕，occludin、ZO-1以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的表達(dá)較高，更有利于保護(hù)腸黏膜。還可以得出，適當(dāng)?shù)脑黾訌?fù)合膳食纖維（DFC）中IDF的比例，更能減輕腸黏膜損傷，有利于緊密連接蛋白和細(xì)胞骨架的修復(fù)，保護(hù)腸黏膜屏障。但是目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，適當(dāng)增加IDF可促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)，對臨床腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的使用有一定的指導(dǎo)作用。

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