李 銳 龔莉瓊 田素飛

1.懷化醫(yī)專附屬懷化市第三人民醫(yī)院檢驗科，湖南懷化 418000；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110001

非發(fā)酵菌是指一群不發(fā)酵糖類或僅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厭氧的無芽胞革蘭陰性桿菌，包括不動桿菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬等在內(nèi)的9個屬近百種細菌。近年來，由于各種廣譜抗菌藥物、化學治療、放射治療、侵襲性操作的開展及免疫抑制劑的應用，使非發(fā)酵菌已成為機會感染與醫(yī)院感染的主要致病菌，尤其是銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌。并且這些菌株往往表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床治療造成了極大的困難。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是革蘭陰性桿菌最重要的耐藥機制，其中以產(chǎn)ESBLs和碳青霉烯酶最具有臨床意義。本研究對2011年6月～2012年6月懷化市第三人民醫(yī)院156株非發(fā)酵菌進行耐藥性及產(chǎn)ESBLs和碳青霉烯酶分析，旨在為臨床合理使用抗菌藥物、降低醫(yī)院感染發(fā)生率、預防和控制非發(fā)酵菌感染提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集懷化市第三人民醫(yī)院2011年6月～2012年6月各臨床科室送檢的微生物標本中分離的非發(fā)酵菌156株，同一患者無重復標本。

1.2 主要試劑與儀器

美羅培南（MEM）、亞胺培南（IPM）、哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）、 頭孢吡肟 （FEP）、 頭孢他啶 （CAZ）、 頭孢噻肟（CTX）、頭孢哌酮/舒巴坦（CFP/SU）、阿米卡星（AK）、環(huán)丙沙星（CIP）、氨曲南（ATM）、慶大霉素（GM）、妥布霉素（TPM）、復方新諾明（SXT）、氨芐西林（AMP）、左旋氧氟沙星（LEV）、頭孢噻肟/棒酸（CD03，30/10 μg）、頭孢他啶/棒酸（CD02，30/10μg），均為英國OXO ID公司產(chǎn)品；M-H培養(yǎng)基干粉，由杭州天和微生物試劑有限公司提供；VITEK-2全自動微生物分析儀及與其配套的GN革蘭陰性桿菌鑒定卡和YST GN13藥敏試驗卡，由法國生物梅里埃公司提供。

1.3 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)、鑒定

按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）進行細菌的分離培養(yǎng)和常規(guī)鑒定，采用Vitek-2微生物分析系統(tǒng)進行鑒定。

1.5 藥物敏感性試驗

根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會（CLSL/NCCLS 2010版）標準采用紙片擴散法（K-B法）檢測常見非發(fā)酵菌對15種抗生素（IPM、MEM、PIP/TZ、FEP、CAZ）、CTX、CFP/SU、AK、CIP、ATM、GM、TPM、SXT、AMP、LEV）的耐藥性。 將大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853作為藥敏試驗質(zhì)控菌株。結(jié)果判斷參照NCCLS 2010年判斷標準。

1.6 β-內(nèi)酰胺酶檢測

初篩試驗（CAZ≤22 mm，CTX ≤27 mm，ATM ≤27 mm，F(xiàn)EP≤22 mm）為陽性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌按NCCLS確認試驗檢測 （紙片增效試驗），即CTX （30μg），CTX/CLV （CD03，30/10 μg） 與 CAZ （30 μg），CAZ/CLV（CD02，30/10μg），任意一對含酶抑制劑紙片抑菌圈直徑增加≥5 mm為ESBLs陽性。具體步驟參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）。質(zhì)控菌株選用ESBLs陽性的肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.7 碳青霉烯酶檢測

將耐IPM或MEM的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌分別采用改良Hodge試驗（MHT，指示菌為大腸埃希菌ATCC 25922）、銅綠假單胞菌改良Hodge試驗（PAE-MHT，指示菌為肺炎克雷伯菌ATCC 700603）兩種方法進行碳青霉烯酶檢測。陽性質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，陰性質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。用生理鹽水配制0.5麥氏標準的指示菌，再用鹽水1∶1稀釋，按常規(guī)紙片擴散法程序接種 MHA，使平板干燥 3～10 min，使用 10μL接種環(huán)挑取血瓊脂平板過夜生長的3～5個試驗菌落或質(zhì)控菌株，從紙片邊緣向外劃直線，劃線長20～25 mm，在平板表面放置美羅培南紙片，置空氣環(huán)境，（35±2）℃培養(yǎng) 16～20 h。 如果在抑菌圈與試驗菌株或質(zhì)控菌株劃線交叉處出現(xiàn)增強生長現(xiàn)象，則表示碳青霉烯酶陽性，如無增強現(xiàn)象則碳青霉烯酶陰性。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Kappa檢驗評價兩種改良Hodge試驗的一致性，當Kappa＞0.7時，兩者一致性較好，當0.4≤Kappa≤0.7時，兩者一致性一般，當Kappa＜0.4時，兩者一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 非發(fā)酵菌的種類及分布

156株非發(fā)酵菌主要為：鮑曼不動桿菌 （76/156）、銅綠假單胞菌 （48/156）、嗜麥芽窄食單胞菌 （17/156）及其他（15/156）（表 1）。 這些標本主要來自于 ICU（103/156）、呼吸內(nèi)科（15/156）、神經(jīng)外科（16/156）、神經(jīng)內(nèi)科（8/156）及其他科室（14/156）。76.2%的菌株來自痰液、呼吸道導管、支氣管灌洗液等呼吸道標本，其余依次為膽汁引流液、穿刺液、創(chuàng)面分泌物、尿液、膿液、其他標本。

表1 156株非發(fā)酵菌的分布

2.2 主要非發(fā)酵菌的耐藥譜

鮑曼不動桿菌對CLSI推薦的15種抗菌藥物耐藥率為28.9%～100.0%，耐藥率較低的抗菌藥物是頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星；銅綠假單胞菌耐藥率為31.6%～93.2%，耐藥率較低的抗菌藥物是哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星；嗜麥芽窄食單胞菌耐藥率為21.2%～100.0%，對亞胺培南耐藥率最高為100.0%，同時對頭孢吡肟也表現(xiàn)出高度耐藥達95.7%，耐藥率較低的抗菌藥物是頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、復方新諾明、左旋氧氟沙星。其他非發(fā)酵菌株因分離株數(shù)過少，不具代表性，故沒有給與耐藥譜分析。見表2。

表2 主要非發(fā)酵菌對抗菌藥物的耐藥率（%）

2.3 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌的檢出率

76株鮑曼不動桿菌中初篩陽性58株，經(jīng)確認試驗檢測產(chǎn)ESBLs 21株，檢出率為27.6%；48株銅綠假單胞菌中初篩陽性41株，經(jīng)確認試驗檢測產(chǎn)ESBLs 18株，檢出率為37.5%；ESBLs總檢出率為31.45% 。

2.4 產(chǎn)碳青霉烯酶細菌的檢出率及兩種改良Hodge試驗的比較

82株碳青霉烯類耐藥非發(fā)酵菌中，鮑曼不動桿菌52株，銅綠假單胞菌30株。兩種改良Hodge試驗檢測鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶的一致性較好，Kappa值為0.86（表3）；兩種改良Hodge試驗檢測銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的一致性一般，Kappa值為 0.58（表 4）。

表3 兩種改良Hodge試驗檢測鮑曼不動桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶情況（株）

表4 兩種改良Hodge試驗檢測銅綠假單胞菌產(chǎn)碳青霉烯酶情況（株）

3 討論

在分離的156株非發(fā)酵菌中，鮑曼不動桿菌居于首位（48.72%），其次是銅綠假單胞菌（30.77%）和嗜麥芽窄食單胞菌（10.90%），結(jié)果與國內(nèi)學者鞠曉紅等[1]的報道一致。本研究收集的非發(fā)酵菌主要來自ICU，與任利珍等[2]報道一致。原因可能為ICU患者年齡偏大，不但多存在較嚴重的基礎疾病，并且常接受侵入性檢測和介入治療，住院期間長時期使用多種廣譜抗菌藥物，使得耐藥率高的非發(fā)酵菌定植生長。全國醫(yī)院感染監(jiān)測網(wǎng)歷年統(tǒng)計均表明，呼吸系統(tǒng)感染為各部位醫(yī)院感染之首。本研究顯示，呼吸道感染占76.2%，與朱道等[3]的報道一致。

對多種抗菌藥物天然耐藥以及使用抗菌藥物后又發(fā)生獲得性耐藥，是非發(fā)酵菌耐藥性的一個重要特點[4]，如產(chǎn)生ESBLs，和氨基糖苷類修飾物、外膜蛋白改變、DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構酶Ⅳ基因突變引發(fā)耐藥[5]，同時整合子-基因盒系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的耐藥中發(fā)揮重要作用[6]。鮑曼不動桿菌被稱為革蘭陰性的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，攜帶多種耐藥基因，對多種抗菌藥物具有天然耐藥性。本研究顯示，鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、左旋氟氧沙星耐藥率為28.9%、58.8%、56.0%，對其余抗菌藥物耐藥率均大于65.0%，臨床可根據(jù)藥敏結(jié)果選用適合的抗菌藥，其中，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達68.6%，意味著其對現(xiàn)有多種抗菌藥物耐藥，提示臨床應嚴格掌握碳青酶烯類抗菌藥物的適應證。銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥率達62.4%，哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星對銅綠假單胞菌具較好抗菌活性，耐藥率分別為36.3%、31.6%、37.5%、36.0%，與王志勤等[7]的報道一致。第三、四代頭孢菌素對革蘭陰性桿菌具較強抗菌活性，本研究顯示，銅綠假單胞菌對其的耐藥性較高，這給臨床抗感染構成嚴重威脅，并易導致抗感染治療的失敗。本研究顯示，嗜麥芽窄食單胞菌對亞胺培南天然耐藥，頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、復方新諾明、左旋氧氟沙星對其具有較強的抗菌活性，耐藥率分別為36.3%、36.4%、21.2%、32.8%，其對頭孢類抗生素的耐藥率較高，均大于60%。

銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌產(chǎn)ESBLs陽性率分別占37.5%、27.6%，與張德忠等[8]的報道一致。銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs株對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率較低，對其余抗菌藥物的耐藥率較高；鮑氏不動桿菌產(chǎn)ESBLs株對亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、阿米卡星耐藥率較低，對其余抗菌藥物的耐藥率較高。

碳青霉烯酶的臨床實驗室檢測對于確定適當?shù)闹委煼桨负蛯嵤└腥究刂拼胧┚哂兄匾饬x。MHT已被廣泛應用于碳青霉烯酶的常規(guī)實驗室檢查，由于其操作簡單，CLSI推薦用MHT試驗來檢測腸桿菌科是否產(chǎn)生碳青霉烯酶，但是該方法并不能檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌感染。Pasteran等[9]研究利用標準化的MHT來檢測腸桿菌時發(fā)現(xiàn)作為質(zhì)控菌的ATCC25922被大部分的待測菌抑制，結(jié)果顯示為不確定。Lee等[10]的報道中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。當改用肺炎克雷伯菌ATCC700603作為指示菌時，可以避免這種抑制生長現(xiàn)象的出現(xiàn)，并且具有高重復性和最佳的靈敏度和特異度，因此，將此命名為銅綠假單胞菌改良Hodge試驗（PAEMHT）。鑒于此，本實驗分別采用MHT和PAE-MHT兩種方法檢測鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的產(chǎn)生，并且比較其檢測能力。檢測鮑曼不動桿菌，兩種方法的一致性較好；檢測銅綠假單胞菌時，兩種方法一致性較差，PAEMHT優(yōu)于MHT，并且PAE-MHT沒有出現(xiàn)不確定的結(jié)果。提示用肺炎克雷伯菌ATCC 700603作為質(zhì)控菌的PAE-MHT試驗能常規(guī)檢測出碳青霉烯酶陽性的銅綠假單胞菌。

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[2]任利珍，干迪郁，朱立軍.兩種常見非發(fā)酵菌的臨床分布及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2012，22（6）：1277-1278.

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