薛一濤 張穎 蘇文革 王世軍 林海青

近年來，大量對原發(fā)性高血壓患者的心理障礙研究發(fā)現(xiàn)，恐懼、憤怒等不良情緒可誘發(fā)高血壓，而高血壓時內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管活性物質(zhì)發(fā)生改變。內(nèi)皮素(endothelin，ET)是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的縮血管活性肽，一氧化氮(nitric oxide，NO)是內(nèi)皮衍生舒張因子，二者均為調(diào)節(jié)血管壓力的重要活性物質(zhì);血管細(xì)胞黏附分子 1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和可溶性細(xì)胞間黏附分子1(soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1)在維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及發(fā)揮正常的生物學(xué)作用方面具有重要作用。本研究通過復(fù)制恐志動物模型，從血管活性物質(zhì)及胸主動脈形態(tài)學(xué)變化的角度，直觀地揭示恐志對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)內(nèi)皮舒張功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑 本實(shí)驗(yàn)NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ET試劑盒購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;sICAM-1及VCAM-1試劑盒購自北京科盈美科技有限公司。

1.1.2 儀器及設(shè)備 SN-695型智能放免γ測量儀，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司生產(chǎn);DDL-5冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠生產(chǎn);電熱恒溫水溫箱HWI，北京醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);全自動洗板機(jī)RT-3000、酶標(biāo)分析儀RT-6000，深圳雷杜公司生產(chǎn);IB-5離子濺射儀，日本Eiko公司生產(chǎn);日立S-570掃描電子顯微鏡，日本日立公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

選擇8周齡、雄性SHR 20只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)和8周齡、雄性Wistar Kyoto(WKY)大鼠10只(購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)作為實(shí)驗(yàn)對象，體質(zhì)量117～135 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 將WKY大鼠10只設(shè)為正常對照組;將20只SHR按簡單隨機(jī)抽樣方法分為2組，SHR對照組和SHR恐志組，每組各10只。其中，SHR對照組和WKY組正常飼養(yǎng)，不給予任何刺激因素;SHR恐志組則給予實(shí)驗(yàn)性的恐志刺激因素。

1.3.2 模型制作方法 參照劉曉偉等［1］的大鼠恐志模型制作方法，同時參考Takashi方法制備SHR恐志模型。即第9天將SHR單獨(dú)放入電刺激儀(30 cm×40 cm×40 cm)，四周為玻璃，底部鋪設(shè)銅柵，通以1 mA交流電，頂部置10 W日光燈照射;前5 min為適應(yīng)期，后同時給予電擊和聲音刺激，每次10 s，間隔1 min，共30次。第10、11天重復(fù)刺激，同時記錄動物處于凍結(jié)狀態(tài)的時間(除外呼吸運(yùn)動)。本實(shí)驗(yàn)中要求抓取動物動作輕柔，避免不必要的刺激干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 行為學(xué)檢測 SHR恐志組大鼠行為變化:移動緩慢、貼壁，后蜷縮于角落處。聽聞聲音后表現(xiàn)為靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等凍結(jié)姿勢，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動，伴有立毛、肌肉輕微振顫、二便失禁。

1.3.4 指標(biāo)檢測及方法 大鼠干預(yù)期結(jié)束后，均禁食、不禁水12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，制備血清和肝素抗凝血漿，摘取胸主動脈，保存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明進(jìn)行操作，檢測血漿NO、血漿ET、sICAM-1及VCAM-1水平;胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化情況:新鮮材料用2.5%戊二醛固定12 h后，經(jīng)乙醇逐級脫水，每級15 min;臨界點(diǎn)干燥，粘托鍍鉑后掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

表1 3組神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

表1 3組神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

注:與WKY組比較，aP＜0.01;與SHR對照組比較，bP＜0.05

組別 大鼠(只) ET(ng/L) NO(μmol/L) VCAM-1(ng/L) sICAM-1(μg/L)WKY組 10 54.700±4.607 44.200±1.733 780.190± 96.0150.340±0.138 SHR對照組 10 66.213±5.420a 35.450±1.435a 942.742±123.127a 0.794±0.243a SHR恐志組 10 71.348±4.764ab 37.020±1.280ab 1040.746±140.803a 0.847±0.192a

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化

未進(jìn)行光電刺激的WKY組大鼠與SHR對照組大鼠比較，凍結(jié)狀態(tài)時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(3.67±0.65)s比(3.95 ±0.58)s，P＞0.05］，而SHR恐志組大鼠較SHR對照組大鼠凍結(jié)狀態(tài)時間(觀察3 d，取平均值)明顯延長［(10.93±1.38)s比(3.95±0.58)，P＜0.01］，表明光電刺激使 SHR產(chǎn)生恐志傾向，情緒誘導(dǎo)成功。

2.2 大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)及電鏡觀察結(jié)果

2.2.1 神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo) WKY組大鼠的ET、VCAM-1、sICAM-1水平較SHR對照組大鼠低，NO水平較SHR對照組高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);SHR恐志組與SHR對照組相比，ET和NO水平升高(均為P＜0.05)，VCAM-1和sICAM-1水平同樣略高(均為P＞0.05);SHR恐志組與WKY組相比，ET、VCAM-1、sICAM-1 水平升高，NO 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

2.2.2 電鏡觀察結(jié)果本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡觀察大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化共15只，3組各5只。

WKY組胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化:掃描電鏡下可以觀察到WKY正常大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞(EC)呈單層扁平形，梭狀，條帶狀分布，大小均勻，形態(tài)規(guī)整，長軸走形與血流方向一致，細(xì)胞膜較完整，表面相對較光滑，細(xì)胞核區(qū)稍隆起，排列整齊而緊密，細(xì)胞的寬部與相鄰細(xì)胞的窄部鑲嵌排列，細(xì)胞間隙小，連接處有較矮的嵴(圖1、圖2)。

圖1 WKY對照組4號大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×600);圖2 WKY對照組4號大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×2000);圖3 SHR對照組2號大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×600);圖4 SHR對照組2號大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×2000);圖5 SHR對照組1號大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×600);圖6 SHR對照組1號大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×2000);圖7 SHR恐志模型組2號大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×600);圖8 SHR恐志模型組2號大鼠內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×2000)

SHR對照組胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化:掃描電鏡下觀察SHR對照組大鼠的胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)均有不同程度的變化，輕者內(nèi)皮細(xì)胞基本上仍呈梭形，排列欠佳，細(xì)胞膜呈條狀撕脫(圖3、圖4);重者細(xì)胞皺縮變小，多呈不規(guī)則形，細(xì)胞膜損傷明顯，甚至脫落，并可見到內(nèi)皮下層的裸露區(qū)，細(xì)胞大小不均勻，無沉積物，細(xì)胞排列不規(guī)則，無明顯方向性，間隙較正常明顯變大(圖5、圖6)。

SHR恐志模型組胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化:掃描電鏡下，可以觀察到恐志模型組大鼠胸主動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞排列極度紊亂，大小不一，整個細(xì)胞失去原有的表面形態(tài)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，脫落較徹底，在損傷較嚴(yán)重的區(qū)域，內(nèi)皮細(xì)胞大片脫落，內(nèi)皮層表面沉積物較多，被粗細(xì)不等，交錯成網(wǎng)的纖維狀物質(zhì)包裹(圖7、圖8)。

3 討論

3.1 血管內(nèi)皮相關(guān)活性物質(zhì)研究

ET是一種肽類縮血管物質(zhì)，分為 ET-1、ET-2、ET-3 3種亞型，其中ET-1是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的縮血管活性肽。NO是一種自由基及內(nèi)源性松弛因子，它是維持血管基礎(chǔ)張力的重要生理調(diào)節(jié)物質(zhì)，是獨(dú)立于交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素之外的血壓調(diào)節(jié)因子［2-3］。研究表明，二者是維持血管基礎(chǔ)張力的主要活性物質(zhì)，相互拮抗，相互影響，維持基礎(chǔ)血壓。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)導(dǎo)致NO、ET合成與代謝的紊亂，參與許多心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展，其中高血壓是最重要的疾病。VCAM-1和sICAM-1同為細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，參與不同細(xì)胞間的識別和黏附［4］。有研究表明，原發(fā)性高血壓時白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加以及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和內(nèi)皮損傷，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)［5］。

3.2 血管內(nèi)皮層與掃描電鏡的相關(guān)研究

掃描電鏡主要是用來觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)的變化，盡管它不能直接測定內(nèi)皮細(xì)胞的功能，但細(xì)胞的功能是建立在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整上的，因此我們可以通過觀察內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)來推測內(nèi)皮細(xì)胞的功能［6］。國內(nèi)外也有學(xué)者研究壓力對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，但關(guān)于恐志刺激后高血壓者內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及形成原因的相關(guān)研究較少。

3.3 方法選擇依據(jù)

本實(shí)驗(yàn)是在參照Takashi方法并改良憤怒大鼠應(yīng)激模型建立方法，即通過間斷、低頻、低壓交流電電擊大鼠足底，使動物反復(fù)受到刺激，結(jié)合同步閃電照射，2 d后大鼠可產(chǎn)生恐懼心理和行為，表現(xiàn)為長時間的靜止和蜷縮等。凍結(jié)姿態(tài)能夠客觀、有效地反映動物的恐懼情緒水平。此模型為國內(nèi)外常用的恐懼情緒動物模型，有效排除軀體刺激干擾，且量化評定方法直觀、可靠［7］。

3.4 檢測結(jié)果分析

3.4.1 NO、VCAM-1、sICAM-1 結(jié)果分析 在本實(shí)驗(yàn)中，SHR光電刺激后NO水平較刺激前增加(P＜0.05)，與劉成偉等［7］、葉林書和朱桐春［8］的研究結(jié)果相符合，目前推測可能是早期高血壓由于ET的水平增高，促進(jìn)了NO的釋放，為機(jī)體保護(hù)性的代償反應(yīng)，以拮抗ET的收縮血管的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明早期高血壓ET與NO水平呈顯著正相關(guān);另一方面，也可能是由于在不同的血管中NO活性不同，各類血管NO的基礎(chǔ)釋放量、血管對NO釋放促進(jìn)因素的敏感性、血管受體的反應(yīng)性以及血流速度不同所造成的，此外還可能與樣本量不足有關(guān)，具體的體制有待進(jìn)一步研究。

而VCAM-1和sICAM-1雖增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，考慮可能是因?yàn)閂CAM-1和sICAM-1廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等表面，正常情況下很少表達(dá)或是不表達(dá)，當(dāng)受到各種刺激因素誘導(dǎo)后可大量表達(dá)，并且與高血壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。血清VCAM-1和sICAM-1的產(chǎn)生可能是依賴內(nèi)皮細(xì)胞激活而持續(xù)不斷地合成并且停留在內(nèi)皮細(xì)胞表面，直到脫落進(jìn)入血液循環(huán)所形成的，但是這需要一個生理過程及一定的時間做出反饋，本實(shí)驗(yàn)可能由于刺激的時間及強(qiáng)度不足，機(jī)體未作出充分的反饋調(diào)節(jié)，也可能與樣本量過小有關(guān)，具體原因需要更進(jìn)一步的研究。

3.4.2 電鏡觀察結(jié)果分析 通過掃描電鏡觀察，正常大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的這種排列有利于血液的流動，可以最大限度地降低血流阻力。本實(shí)驗(yàn)對照組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的電鏡觀察結(jié)果與以往的文獻(xiàn)記載相符［9-10］。隨著血壓的增高，5只SHR的內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)較對照組均有不同程度的變化，表明高血壓內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有個體差異性。血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，其意義在于適應(yīng)壓力的作用，最大限度地減少其對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，保持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的完整性。給予光電刺激后的SHR恐志大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化顯著重于SHR對照組大鼠，分析沉積物的成分可能主要是脫落細(xì)胞、細(xì)胞碎片和壞死物質(zhì)，纖維狀物質(zhì)可能是由纖維蛋白、組織碎片等組成，表明細(xì)胞損傷較嚴(yán)重，造成大量細(xì)胞壞死。形成原因可能是因?yàn)橛枰韵鄳?yīng)恐志刺激后，在應(yīng)激狀態(tài)下SHR血壓迅速升高，ET/NO嚴(yán)重失衡，外周阻力增加，加重了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，內(nèi)皮細(xì)胞呈大片狀脫落，血液代謝能力下降，血流速度減慢而致。有研究證明，壓力刺激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增生-血管重構(gòu)等形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，這些改變直接使血管彈性降低，血流阻力增加，血流速度減慢。本實(shí)驗(yàn)中SHR恐志組大鼠血管內(nèi)皮層出現(xiàn)大量纖維狀物質(zhì)，表明恐志刺激等應(yīng)激狀態(tài)可引起并加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和血管通透性增加。液壓擴(kuò)張也可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，纖維及血小板附著等病理性改變。

根據(jù)3組鏡下觀察的損傷程度，提示內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及脫落程度與高血壓病變的發(fā)展程度呈正相關(guān)，并呈進(jìn)行性發(fā)展，是一個由輕變重的逐步發(fā)展的過程。因內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、排列等在體內(nèi)受諸多因素的影響，生物力學(xué)工作者以流體力學(xué)的觀點(diǎn)及原理認(rèn)為不同部位的血管內(nèi)皮壁面不同區(qū)域受到血液流動的剪切應(yīng)力是不同的，在體內(nèi)脈動流的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的不同形態(tài)與流體力學(xué)作用下所造成的切變應(yīng)力不同有關(guān)，因此，是否恐志高血壓大鼠體內(nèi)其他部位血管內(nèi)皮細(xì)胞也是這種變化需要進(jìn)一步的研究;此外取材時血管所處的狀態(tài)、所受的壓力等因素均可對血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生影響，因目前相關(guān)研究較少，故有關(guān)此方面的資料有待進(jìn)一步的積累。

本研究結(jié)果表明，SHR大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌功能及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷較WKY大鼠發(fā)生明顯變化;恐志刺激能延長高血壓大鼠的凍結(jié)時間，改變高血壓大鼠行為，同時可影響高血壓大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌功能，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。

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