尹廣利 王植榮 郭藝芳 馮子南 王慶海 劉芳茹 楊寶剛 王慶凱

近年研究表明，人體血壓呈現(xiàn)為典型的近日節(jié)律性(circadian rhythm)，且這種節(jié)律現(xiàn)象的發(fā)生與內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素1(endothelin1，ET-1)和一氧化氮(nitric oxide，NO)活性水平的晝夜波動具有密切關(guān)系［1］。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)改善血壓的基本節(jié)律特征與降低血壓的均值同等重要。珍菊降壓片是臨床治療高血壓病的常選藥物之一，由野菊花膏粉、珍珠層粉、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁組成的中西藥復(fù)方制劑。為了解珍菊降壓片與鈣離子拮抗劑聯(lián)用后對血壓及血管內(nèi)皮功能的晝夜節(jié)律影響，并探索一種傳統(tǒng)中藥制劑與西藥相結(jié)合治療高血壓的新方法，我們以大鼠為實驗對象，比較了聯(lián)服珍菊降壓片、氨氯地平片與單服氨氯地平片前、后血ET-1、NO和收縮壓晝夜節(jié)律變化，為探討抗高血壓藥物對血壓、內(nèi)皮源性物質(zhì)晝夜節(jié)律的影響以及中西藥物干預(yù)效果奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級健康10周齡SD大鼠64只(購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，體重250～300 g，雌雄各32只，常規(guī)飼養(yǎng)于河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗室，自由進食，室溫維持在(22±2)℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為兩大組:(1)灌服苯磺酸氨氯地平片組(組Ⅰ):32只，每日給予苯磺酸氨氯地平片2.5 mg·kg－1·d－1灌胃(由輝瑞公司提供);(2)灌服苯磺酸氨氯地平片和珍菊降壓片組(組Ⅱ):32只，每日在灌服苯磺酸氨氯地平片基礎(chǔ)上，給予珍菊降壓片 40 mg·kg－1·d－1(每片珍菊降壓片含有野菊花膏粉100 mg、珍珠層粉100 mg、鹽酸可樂定30 ug、氫氯噻嗪5 mg、蘆丁20 mg)灌胃，分早、中、晚3次灌服。每大組又分4小組，每小組各8只。

1.2 方法

1.2.1 血壓測定 所有大鼠灌胃前1 d和灌胃后4周末，采用RBP-1B型光電法鼠尾測定儀(中日友好醫(yī)院生產(chǎn))于不同時間點(02∶00、08∶00、14∶00、20∶00)測定大鼠的收縮壓，每個時間點分別測量兩大組中各一小組大鼠的收縮壓。

1.2.2 動物處死及取材 灌胃后4周末，分別于不同時間點(02∶00、08∶00、14∶00、20∶00)處死大鼠，每次分別處死兩大組中各一小組大鼠，取血2 ml置入盛有10%依地酸二鈉30 μl、抑肽酶20 μl的 EP管中，低溫離心，3000轉(zhuǎn)/min，留取血漿，－20℃保存?zhèn)溆?。取? ml置入試管中，低溫離心，300轉(zhuǎn)/min，留取血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標測定 采用放射免疫測定ET-1含量。藥盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫研究所，按說明書操作。采用硝酸還原酶法測定NO水平。試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用余弦擬合法(cosine fitting)統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，以Yi=M+Acos(ωti+Φ)為基本模型［2］。式中Yi為 ti時刻收縮壓和血液中 ET-1、NO含量;M是余弦曲線的中值;A為曲線的振幅;ω為曲線的角頻率;Φ為峰值相位(亦即峰值時刻的角頻率)［2-3］。在本研究中，Yi為收縮壓和血液中ET-1、NO 含量;ω =2π/τ即 360/24=15，即將 24 h視作360度角，每小時相當于15度角;ti代表24 h制的時間，即0、1、2……23 h;其余則為待測或計算值。將每只大鼠24 h中每次的測定值代入前述模型，然后根據(jù)最小二乘法(the least square)原理，采用組平均余弦擬合法做擬合度檢驗，如P＜0.05則接受檢驗假設(shè)，說明該指標的分布節(jié)律可由上述模型正確描述。然后采用零振幅檢驗(zero amplitude test)［2］評價各指標的近日節(jié)律是否確實存在，如P＜0.05則說明該指標呈現(xiàn)為晝夜節(jié)律，而非無節(jié)律的隨機分布。同時求得余弦分布曲線的各個特征值，即M、A及Φ。應(yīng)用t檢驗，比較兩組大鼠灌胃前后擬合曲線特征值的差異顯著性，如P＜0.05則視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 兩組大鼠服藥前后不同時段檢測結(jié)果(±s)

表1 兩組大鼠服藥前后不同時段檢測結(jié)果(±s)

注:與治療前相比，aP＜0.05，與組Ⅰ比，bP＜0.05

組別 收縮壓(mm Hg)ET-1(ng/L)NO(μmol/L)治療前 治療后組Ⅰ治療前 治療后 治療前 治療后02∶00 106.2± 7.1 84.6±10.9b 110.4±20.7 87.9±14.3b 30.5± 5.6 64.3±10.5b 08∶00 96.8± 4.1 94.6±12.1b 100.3±13.1 84.0±18.6b 28.6± 3.8 30.4± 3.7b 14∶00 108.0± 7.9 101.0± 5.1b 97.5± 5.8 85.1± 2.6b 26.6± 3.3 55.8±12.1b 20∶00 101.6± 8.9 96.2± 7.8b 73.4± 3.9 63.6± 4.2b 32.5±10.1 38.2± 8.7b組Ⅱ02∶00 105.2± 7.3a 78.8± 7.9b 109.3±10.7a 75.4± 9.7b 31.1± 5.6a 74.5±10.1b 08∶00 95.6± 3.4a 86.8± 8.8b 102.3±10.3a 72.2± 5.9b 27.6± 4.7a 54.2± 5.6b 14∶00 112.0± 7.4a 90.2± 4.0b 97.8± 6.1a 65.4± 4.9b 24.5± 3.3a 62.2±10.6b 20∶00 100.6±10.1a 89.6± 7.1b 70.4± 4.4a 62.5± 6.9b 30.5± 8.8a 40.3± 8.8b

2 結(jié)果

組Ⅰ、組Ⅱ治療前收縮壓、血ET-1和NO比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)，組Ⅰ、組Ⅱ治療后血漿ET-1水平均降低、血清NO均升高，但與組Ⅰ相比，以組Ⅱ治療后血ET-1和NO水平變化差異更顯著(P＜0.05，表1)。組Ⅰ、組Ⅱ治療后收縮壓均明顯降低(P＜0.05，表1)，但組Ⅱ下降幅度更大(P＜0.05，表1)。

應(yīng)用最小二乘法對各組大鼠服藥前后收縮壓、血ET-1和NO進行余弦擬合，得出余弦擬合曲線的特征值(表2)。對其行零振幅檢驗，各組均示P＜0.05，即拒絕曲線振幅為零的檢驗假設(shè)，表明兩組治療前后收縮壓、血ET-1和NO曲線均呈節(jié)律性分布。換言之，各組曲線的基本晝夜節(jié)律均存在。分析各曲線的特征值可見，兩組大鼠治療后收縮壓及血漿ET-1曲線的中值均減小，血清NO曲線的中值增加(P＜0.05)，但組Ⅰ變化幅度較小。此外，兩組大鼠經(jīng)治療后收縮壓、血ET-1和NO曲線峰值相位均發(fā)生了不同程度移位(P＜0.05)。

表2 兩組大鼠治療前后各種檢測結(jié)果的時間生物學(xué)特征的變化

3 討論

正常情況下，人體血壓及心血管系統(tǒng)的其他生理活動均表現(xiàn)出較為典型的近日節(jié)律［4］。近年來大量研究表明，血壓的晝夜分布節(jié)律與高血壓患者預(yù)后及合并癥的發(fā)生有密切關(guān)系。因此許多學(xué)者認為，糾正異常的血壓節(jié)律與降低血壓同等重要。高血壓的機制之一是內(nèi)皮功能受損，導(dǎo)致ET-1/NO失衡。如能逆轉(zhuǎn)失調(diào)的內(nèi)皮功能是當前高血壓治療的新趨勢［5］。因此，研究這些體液因子的晝夜節(jié)律性及降壓藥物對其節(jié)律性的影響，對于深入認識血壓的時間生物學(xué)調(diào)節(jié)機制具有重要意義。

本研究旨在探討藥物是否對血壓晝夜節(jié)律有影響。為避免高血壓所致的血壓晝夜節(jié)律異常，更清晰的認識藥物對節(jié)律的影響，本研究選用了血壓正常的大鼠。這種設(shè)計方案有助于充分認識血壓及血管活性物質(zhì)的生物節(jié)律現(xiàn)象，對于進一步研究血壓生物節(jié)律的形成與維持機制以及藥物的可能影響具有重要意義。國內(nèi)最新的高血壓防治指南提倡聯(lián)合治療。目前傳統(tǒng)和新型西藥間的聯(lián)合較多，而傳統(tǒng)中藥制劑與西藥間的聯(lián)合臨床報道較少。珍菊降壓片為中西藥物組成的常用復(fù)方降壓制劑，其質(zhì)量標準已收載于部頒中藥20冊，標準編號WS3-B-3925-98［6-7］。研究表明，珍菊降壓片能增加 NOS 及mRNA的表達，升高NO含量，保護和修復(fù)內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)體內(nèi) NO和 ET-1平衡，從而降低血壓［8］。Asanuma等［9］發(fā)現(xiàn)氨氯地平片能增加NO釋放，改善內(nèi)皮功能。珍菊降壓片與氨氯地平片在改善血管內(nèi)皮功能和降壓方面能產(chǎn)生良好的協(xié)同作用。本研究顯示，珍菊降壓片和氨氯地平片中西藥物聯(lián)合應(yīng)用可進一步使NO增加，更好的保護血管內(nèi)皮功能，從而進一步控制血壓。同時本研究發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合應(yīng)用還可以降低ET-1水平，具體機制還有待進一步證實。

總之，珍菊降壓片聯(lián)用氨氯地平片后在改善血管內(nèi)皮功能方面具有良好協(xié)同作用，較單服氨氯地平片有更好的血壓控制作用，符合當前降壓治療的新趨勢?？勺鳛閭鹘y(tǒng)中藥制劑與西藥相結(jié)合治療血壓的又一有效方法。本研究顯示，應(yīng)用珍菊降壓片和氨氯地平片后血ET-1、NO及收縮壓均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律現(xiàn)象，而節(jié)律的維持可進一步保護靶器官，減少心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率，有待隨機對照的大樣本臨床試驗進一步證實。

［1］Yu LJ，Guo YF.Effects of endothelial vasoactive substances on the circadian rhythms of blood pressure.Chinese Joural of Medicinal，2008，10:182-187.(in Chinese)

于立杰，郭藝芳.血管內(nèi)皮源性活性物質(zhì)對血壓晝夜節(jié)律的影響.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2008，10:182-187.

［2］Nelson W，Tong YL，Lee JK，et al.Methods for cosinorrhythmometry.Chronobiologia，1979，6:305-323.

［3］Cornelissen G，Bakken E，Delmore P，et al.From various kinds of heart rate variability to chronocardiology.Am J Cardiol，1990，66:863-868.

［4］Guo YF，Stein PK.Circadian Rhythm in the Cardiovascular System:Chronocardiology.Am Heart J，2003，145:779-786.

［5］Zhao SH，Gao HQ，Qiu J.Research progress of Profilin-1 in endothelial function.Chin J Geriatr，2011，30:784-787.(in Chinese)

趙韶華，高海青，邱潔.前纖維蛋白-1對內(nèi)皮功能影響的研究進展.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2011，30:784-787.

［6］Gong QH，Ruan J. HPLC determination ofthe contents Chlorogenic acid and Hydrochlorothiazide in Zhenjujiangyapian.China Journal of Chinese Materia，2011，36:481-483.(in Chinese)

宮欽紅，阮健.珍菊降壓片中綠原酸與氫氯噻嗪的含量測定.中國中藥雜志，2011，36:481-483.

［7］Cai SD.Determination of clonidine hydrochloride in Zhenju Jiangya Tablets by HPLC.China medical herald，2011，16:66-67.(in Chinese)

蔡紹東.高效液相色譜法測定珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，16:66-67.

［8］Hou XM，Ni HC，Luo XP，et al.Effect of Zhenju Jiangya Tablet on the endothelial function of hyperlipidemic rabbits.J Chin Integr Med，2004，2:111-114.(in Chinese)

侯旭敏，倪喚春，羅心平，等.珍菊降壓片對高脂血癥兔內(nèi)皮功能的改善作用.中西醫(yī)結(jié)合報，2004，2:111-114.

［9］Asanuma H，Minamino T，Sanada S，et al.A calcium channel blocker amlodipine increases coronary blood flow via both adenosine-and NO-dependent mechanisms in ischemic hearts.J Mol Cell Cardiol，2005，39:605-614.