周先漢，吳克平,*，曾慶梅，鄒旭鵬，林秀峰

溶菌酶協(xié)同高壓CO2對酸土脂環(huán)酸桿菌芽孢的致死效果

周先漢1，吳克平1,*，曾慶梅2，鄒旭鵬1，林秀峰1

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；
2.合肥工業(yè)大學 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

以芽孢致死率為評價指標，通過單因素和正交試驗考察溶菌酶添加量、壓力、溫度和時間在高壓CO2處理過程中對酸土脂環(huán)酸桿菌芽孢致死效果的影響，并優(yōu)化殺菌條件。結(jié)果顯示:溶菌酶添加量、壓力和溫度對芽孢致死效果的影響均顯著(P＜0.05)，在溶菌酶添加量0.10g/kg、壓力25MPa、溫度55℃、時間60min的優(yōu)化條件下芽孢致死率可達到5.47個數(shù)量級。另對此條件下處理后的樣品進行高效液相色譜(HPLC)和掃描電子顯微鏡(SEM)檢測，結(jié)果顯示:芽孢核心物質(zhì)2,6-吡啶二羧酸(DPA)發(fā)生大量泄露，且部分芽孢完全破裂，溶菌酶對高壓CO2殺滅芽孢的協(xié)同效果顯著(P＜0.05)。

高壓CO2；溶菌酶；酸土脂環(huán)酸桿菌；芽孢致死率；2,6-吡啶二羧酸(DPA)；掃描電子顯微鏡鏡(SEM)

酸土脂環(huán)酸桿菌是導致蘋果汁、橘汁等熱敏性果汁腐敗的主要菌種[1-2]。該菌是一類產(chǎn)芽孢的嗜酸耐熱菌，其孢子有很強的抗逆性，能經(jīng)受95℃、2min的滅菌處理存活下來，并可在pH＜4的果汁中萌發(fā)生長而導致其腐敗，熱處理須在121℃條件下至少15min才能將其徹底殺滅[3]，這勢必會對果汁的品質(zhì)和營養(yǎng)造成極大破壞。

高壓CO2技術(shù)(high pressure carbon dioxide，HPCD)是一種新型的冷殺菌技術(shù)，殺菌條件溫和、低成本、無毒無殘留，在熱敏性果汁殺菌領(lǐng)域有著巨大前景[4]。目前，高壓CO2殺菌方法在壓力低于50MPa，溫度低于60℃時能殺滅大約5～12個對數(shù)的營養(yǎng)細胞[5]，而對于細菌芽孢，單純采用高壓CO2在溫和條件下難以達到理想的殺菌效果[6-7]。因此，為了減少芽孢對果汁的不利影響，實現(xiàn)在溫和條件下有效殺滅芽孢，有必要采取有效措施來協(xié)同高壓CO2殺菌。根據(jù)GB2760—2011《食品添加劑使用標準》，溶菌酶是一種天然抗菌免疫蛋白，具有無毒、易分解、無殘留等優(yōu)點，可用于食品的防腐保鮮，而且其化學性質(zhì)穩(wěn)定，在酸性條件下熱穩(wěn)定性強，能適應(yīng)果汁的酸性環(huán)境[8]。曾慶孝等[9]對溶菌酶協(xié)同高靜壓殺滅嗜熱脂肪桿菌芽孢的研究表明，溶菌酶有助于提高芽孢對壓力的敏感性。目前有關(guān)溶菌酶協(xié)同高壓CO2滅菌效果的研究還未見報道。本研究將調(diào)查研究溶菌酶用于協(xié)同高壓CO2對芽孢的致死效果，并通過電鏡觀察和芽孢內(nèi)容物的檢測，初步推測芽孢的致死過程，旨在為高壓CO2殺菌技術(shù)的進一步研究及其應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris 10374)、CICC403#液體培養(yǎng)基 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

Na2HPO4、檸檬酸 無錫展望化工試劑有限公司；溶菌酶(20000U/mg) 上海源聚生物科技公司；CO2氣體(純度99.99%) 合肥恒隆氣體制造有限公司；2,6-吡啶二羧酸(色譜純) 上海晶純試劑有限公司。

CICC403#液體培養(yǎng)基配方(pH4.0，固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中添加瓊脂15g):CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.2g、KH2PO43.0g、葡萄糖 5.0g、酵母膏2.0g、蒸餾水1L。所用培養(yǎng)基試劑均為分析純；緩沖溶液(pH3.74)包括:0.1mol/L Na2HPO4、0.2mol/L檸檬酸。

1.2 儀器與設(shè)備

HA121-50-01-C超臨界CO2萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；TDL-50B臺式離心機 上海安亭科學器械廠；SWO-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SYQ-DSX-Z898手提式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；YY0027-90電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；ACQUITY UPLC-LCT Premier XE液相色譜儀美國Waters公司；JSM-6490LV 掃描電子顯微鏡 日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備[10]

用接種環(huán)將酸土脂環(huán)酸桿菌從斜面接種至液體培養(yǎng)基中，置于45℃搖床中活化培養(yǎng)24h。取適量活化菌液至固體培養(yǎng)基上，于45℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，置室溫中培養(yǎng)4～5d，鏡檢芽孢數(shù)達到90%～95%時，在無菌條件下用無菌蒸餾水洗脫菌苔；4℃、5000r/min離心15min，棄上清液，用無菌蒸餾水清洗離心2次后，沉淀倒入無菌蒸餾水，(85±1)℃水浴30min殺死營養(yǎng)體，制成109～1010CFU/mL菌懸液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 活菌數(shù)的檢驗

采用平板菌落計數(shù)法。將實驗處理前后菌液稀釋至一定濃度后，涂布于CTCC403#固體培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)48h后計數(shù)，計數(shù)方法參照GB4789.21—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 冷凍飲品、飲料檢驗》。

1.3.3 溶菌酶協(xié)同高壓CO2處理

以10mL芽孢菌懸液加入到190mL無菌緩沖溶液中配成的200mL菌液作為處理基質(zhì)。重復3次，取平均值。

單因素試驗:分別考察以下4個因素對芽孢致死率的影響。

1)溶菌酶添加量:分別添加0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10g/kg溶菌酶后，立即將菌液倒入高壓CO2萃取釜，在30MPa、50℃條件下處理60min。

2)處理壓力:將溶菌酶(前一組優(yōu)化得到的最佳添加量)加入菌液中，保持溫度為50℃，分別在10、15、20、25、30、35MPa處理60min。

3)處理溫度:固定其他條件(取前兩組優(yōu)化得到的溶菌酶添加量和處理壓力)，分別在25、35、40、50、60、70℃條件下處理60min。

4)處理時間:固定其他條件(取前三組優(yōu)化得到的溶菌酶添加量、處理壓力和溫度)，分別處理20、30、40、50、60、90min。

正交試驗:依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取L9(34)正交試驗表，進一步優(yōu)化殺菌條件。

1.3.4 芽孢致死率的測定

將處理后的菌液立即進行梯度稀釋后涂布，45℃培養(yǎng)48h后計數(shù)，并按下式計算芽孢致死率。

1.3.52 ,6-吡啶二羧酸(DPA)的檢測

取高壓CO2處理后的菌液40mL，4℃、10000r/min離心10min，取上清液抽濾后進行真空濃縮，然后用0.22μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC分析，色譜條件:色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相:體積比5:95的乙腈-水(10mmol/L乙酸銨＋0.1%甲酸)溶液；流速:0.3mL/min；進樣量:標準品0.5μL，樣液1μL；柱溫:40℃；樣品室溫度: 10℃；進樣周期:5min。

1.3.6 芽孢的電子顯微鏡制樣方法[11]

將蓋玻片裁成4塊，洗凈滅菌，樣品面做好標記。將1%Formvar氯仿溶液滴在作好標記的玻片上，30s后吸干多余的液體，置于60℃烘箱30min后使用。將一定濃度菌懸液滴在制備好的載玻片上，靜置1 0～15min，多余液體用濾紙吸干。待菌液剛蒸發(fā)完畢，加入0.1%戊二醛預固定1h，再用0.5%戊二醛置換固定2h。固定好的樣品用0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次，每次5～10min。將樣品依次置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脫水置換，每級置換時間為10～15min。將上述制備的樣品在超低溫冰箱中冷凍結(jié)晶后，于冷凍干燥機中－20℃干燥約20h，即可在電子顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶菌酶添加量對殺菌效果的影響

圖1 溶菌酶添加量對芽孢致死率的影響Fig.1 Effect of lysozyme dose on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

由圖1可知，在30MPa、50℃條件下處理60min，隨著溶菌酶添加量的增加，芽孢致死率顯著升高(P＜0.05)，添加量在0.06～0.10g/kg之間時，與不添加溶菌酶時相比，其芽孢致死率至少提高了2個對數(shù)級，協(xié)同效果顯著，添加量為0.10g/kg時達到最大；添加量在0.06～0.08g/kg時，差異顯著(P＜0.05)，而在0.08～0.10g/kg時，差異不顯著(P＞0.05)。故選擇溶菌酶添加量在0.08g/kg左右為宜。

圖2 處理壓力對芽孢致死率的影響Fig.2 Effect of pressure on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

2.2 不同壓力對殺菌效果的影響由圖2可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg，溫度50℃處理60min的條件下，壓力在10～25MPa之間對殺菌效果影響顯著(P＜0.05)，隨著壓力的逐漸增大，芽孢致死率逐漸升高，壓力升至25MPa時達到最大，這可能與壓力致CO2滲透性提高和物理性傷害增強有關(guān)。但隨著壓力的繼續(xù)升高，殺菌效果未見增強，可能是壓力過高，導致了芽孢的部分聚集，抗壓性相對增強，從而削弱了殺菌效果[12]。故選擇處理壓力在25MPa左右為宜。

2.3 不同溫度對殺菌效果的影響

圖3 處理溫度對芽孢致死率的影響Fig.3 Effect of temperature on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

由圖3可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg、壓力25MPa處理60min的條件下，隨著處理溫度的升高，芽孢致死率呈先增后減趨勢，溫度在25～50℃之間時芽孢致死率顯著升高(P＜0.05)，溫度為50℃時致死率達到最大。這一變化可能與溶菌酶的活性有較大關(guān)系，據(jù)報道溶菌酶作用的最適溫度為45～50℃[13]；溫度較低時，酶活性較弱，隨著溫度逐漸升高，酶活性逐漸提高，協(xié)同殺菌效果也隨之增強，而溫度達到60℃以后，酶可能部分失活，使殺菌效果有所減弱。故選擇處理溫度在50℃左右為宜。

2.4 不同時間對殺菌效果的影響

由圖4可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg、壓力25MPa、溫度50℃的條件下，隨著處理時間的延長，芽孢致死率逐漸升高(P＜0.05)，在50min以后趨勢逐漸平緩，處理時間90min與60min時相比，致死率僅提高約0.1個對數(shù)，可能是由于芽孢激活的是可逆的，處理時間的延長可能使已被激活的芽孢重新變成休眠狀態(tài)[14]，而且溶菌酶的活性隨著時間的延長也會逐漸降低，這些因素都可能影響殺菌效果。故選擇處理時間在50min左右為宜。

圖4 處理時間對芽孢致死率的影響Fig.4 Effect of treatment time on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

2.5 正交試驗設(shè)計和結(jié)果分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對芽孢致死率影響均顯著(P＜0.05)的溶菌酶添加量、高壓CO2處理壓力、處理溫度、處理時間4因素進行L9(34)正交試驗，因素水平和結(jié)果見表1、2。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表1可知，影響芽孢致死率的因素主次順序為A＞D＞B＞C，獲得高芽孢致死率的因素水平組合為A3B3C3D2，此組合與正交表中芽孢致死率最高的7號試驗組合A3B1C3D2同時進行驗證實驗，驗證結(jié)果顯示，A3B3C3D2組合的芽孢致死率為5.47，略高于7號試驗組合A3B1C3D2的結(jié)果，故確定A3B3C3D2為最佳殺菌方案。

表2 正交試驗方差分析表Table 2 Analysis of variance for the experimet results of orthogonal ayyay design

表2方差分析的結(jié)果顯示，溶菌酶添加量、處理溫度、處理壓力均是影響芽孢致死率為極顯著因素，而處理時間為顯著性因素。綜上所述，溶菌酶協(xié)同高壓CO2殺滅芽孢的最佳條件為溶菌酶0.10g/kg、處理壓力25MPa、處理溫度55℃、處理時間60min。

2.6 DPA檢測結(jié)果對比

圖5 DPA標準品(A)、高壓CO2單獨處理后的菌液(B)以及溶菌酶協(xié)同高壓CO2處理后的菌液(C)的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC profiles of DPA standard and Alicyclobacillus acidoterrestris spores treated with high pressure carbon dioxide alone or combined with lysozyme

DPA是細菌芽孢中特有的物質(zhì)，存在于芽孢的核心部位，約占芽孢干質(zhì)量的10%，它的一個重要功能是降低芽孢核心區(qū)的水分，通過保護芽孢核內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA來提高芽孢的抗性[15]，DPA的泄露量可反映芽孢的受損情況。實驗對最優(yōu)殺菌方案(圖5C)下添加和未添加(圖5B)溶菌酶的高壓CO2處理液中的DPA泄露情況進行了HPLC分析，結(jié)果如圖5所示。添加和未添加溶菌酶的高壓CO2處理液中都檢測到了DPA(保留時間分別為0.56min和0.59min，基本一致)，與未添加溶菌酶的處理液相比，添加了溶菌酶的處理液中DPA含量顯著增加。高瑀瓏等[16]研究認為，芽孢通透性屏障受損，物理結(jié)構(gòu)被破壞，從而引起了芽孢DPA的泄漏，因此，以上結(jié)果說明在溶菌酶協(xié)同高壓CO2作用下對芽孢通透性破壞程度較大，也可能發(fā)生了徹底的破裂，才會導致芽孢最核心的物質(zhì)DPA發(fā)生較多滲漏。

2.7 掃描電子顯微鏡圖對比

在優(yōu)化的最佳殺菌條件下，分別對添加和未添加溶菌酶的高壓CO2處理菌液進行電子顯微鏡制樣及觀察，結(jié)果如圖6所示。

圖6 未處理(A)、高壓CO2單獨處理后的菌液(B) 以及溶菌酶協(xié)同高壓CO2處理后的菌液(C)的芽孢掃描電子顯微鏡圖Fig.6 SEM images of Alicyclobacillus acidoterrestris spores before and after treatment with high pressure carbon dioxide alone or combined with lysozyme

由圖6A可知，未經(jīng)處理的酸土脂環(huán)酸桿菌的芽孢形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，為短桿的橢球形；由圖6B可知，單獨高壓CO2處理后的芽孢大部分表面形態(tài)較完整，有少數(shù)發(fā)生凹陷、破裂、細胞內(nèi)容物滲漏，推測主要是壓力作用和CO2高滲透性產(chǎn)生的萃取作用導致了芽孢壁通透性的改變，芽孢內(nèi)容物發(fā)生滲漏，生理代謝失衡，從而造成了芽孢的死亡；但同時發(fā)現(xiàn)處理后芽孢大部分產(chǎn)生聚集，削弱了壓力和CO2的作用，這可能是導致芽孢致死率低的原因之一。而由圖6C可明顯看到，經(jīng)過溶菌酶協(xié)同處理的芽孢在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的發(fā)生了較大變化，可觀察到一些細胞完全破裂，胞內(nèi)物質(zhì)滲漏和一些細胞壁空殼。可以推斷溶菌酶對芽孢壁成分產(chǎn)生了某種分解作用(芽孢皮層和芽孢壁主要由肽聚糖組成，溶菌酶對肽聚糖分子具有破壞作用[17])，使得在壓力作用下，CO2更容易滲透到芽孢內(nèi)部，在卸壓過程中CO2迅速擴散，使芽孢瞬間脹裂，崩潰。這一結(jié)果也進一步驗證了圖5C中DPA泄漏量較大的原因。

3 結(jié) 論

采用溶菌酶協(xié)同高壓CO2處理優(yōu)化的最佳殺菌條件為溶菌酶0.10g/kg、處理壓力25MPa、處理溫度55℃、處理時間60min，能使芽孢致死率達到5.47個數(shù)量級，與高壓CO2單獨處理(芽孢致死率為3.00個數(shù)量級左右)相比，提高了大約2.47個數(shù)量級。另外，由處理后樣品的高效液相色譜和掃描電鏡檢測結(jié)果判定，溶菌酶對高壓CO2殺菌的協(xié)同效果顯著，兩者共同作用導致了芽孢很大程度地受損和核心物質(zhì)DPA的大量泄漏，從而造成芽孢大量死亡。

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Effects of Various Treatment Conditions on Efficacy of High Pressure Carbon Dioxide in Coordination with Lysozyme for Inactivating Alicyclobacillus acidoterrestris Spores

ZHOU Xian-han1，WU Ke-ping1,*，ZENG Qing-mei2，ZOU Xu-peng1，LIN Xiu-feng1
(1.College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；(2.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

One-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize four treatment conditions including lysozyme dose, pressure, temperature and treatment time that influence the bactericidal activity (evaluated by death rate of spores) of lysozyme in coordination with high pressure carbon dioxide against Alicyclobacillus acidoterrestris spores. The results showed that lysozyme dose, pressure and temperature had a significant effect on the inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores (P＜ 0.05). The death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores reached 5.47 orders of magnitude under the optimized conditions: lysozyme dose 0.10 g/kg, pressure 25 MPa, temperature 55 ℃ and treatment time 60 min. The HPLC analysis and observation under scanning electron microscopy (SEM) of Alicyclobacillus acidoterrestris spores treated under these conditions indicated large amounts of 2,6-pyridine dicarboxylic acid (DPA) leakage and complete rupture of partial spores. In conclusion, lysozyme has a significantly synergistic effect on the inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores by high pressure carbon dioxide (P＜ 0.05).

high pressure carbon dioxide；lysozyme；Alicyclobacillus acidoterrestris；death rate of spores；2,6-pyridine dicarboxylic acid (DPA)；scanning electron microscopy (SEM)

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0001-05

2011-07-07

國家自然科學基金項目(30871739；30571304)；國家“863”計劃項目(2011AA100801)；

安徽省教育廳重點科研項目(KJ2007A099)

周先漢(1959—)，男，副教授，學士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工、食品安全。E-mail:zhxhan@163.com

*通信作者:吳克平(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail:crystal_1024@126.com