鄭 艷，匡立學，李 超，張玉龍*

(沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

洋蔥假單胞菌乳糖酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄭 艷，匡立學，李 超，張玉龍*

(沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

以選育的洋蔥假單胞菌NTG-15-03為生產菌株，通過單因素和回歸正交設計試驗考察菌株種齡、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵液初始pH值對乳糖酸產量的影響。結果表明：在pH7.0、種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時間106h的條件下，該菌株的乳糖酸產量為10.08g/L。

乳糖酸；響應面分析；發(fā)酵

乳糖酸(lactobionic acid，LA)是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖酸通過醚鍵連接起來的一種新型的多羥基有機酸[1]。它可以作為雙歧因子、礦質元素吸收的促進劑、甜味劑、酸味劑、器官移植的保存劑等[2-3]，廣泛的應用于食品加工、醫(yī)藥和精細化工領域。盡管乳糖酸具有多種生理功能，但在我國并沒有實現商業(yè)化生產。目前在美國和歐洲，乳糖酸的生產主要是采用化學合成法[4]。由于該方法在氧化過程中常伴有多種副產物生成，因此生產成本相對較高。微生物發(fā)酵法生產乳糖酸的研究始于20世紀末，但尚未實現產業(yè)化。我國在此方面的研究尚屬空白。

本實驗以選育的洋蔥假單胞菌(Burkholderia cepacia) NTG-15-03為出發(fā)菌株，通過單因素及回歸正交設計試驗對其發(fā)酵條件進行初步研究，以期為乳糖酸的發(fā)酵生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥假單胞菌由沈陽農業(yè)大學食品微生物實驗室分離，編號為菌株NTG-15-03。

乳糖酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Prominence LC-20A高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；Anke TDL-40B精密離心機 上海安亭科學儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器 常州國華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

斜面培養(yǎng)基：乳糖10g、蛋白胨5g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O 0.1g、瓊脂20g、蒸餾水1L，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖10g、玉米漿10g、蛋白胨1g、NaCl 2g、K2HPO41g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

1.3.2 菌種的活化

將低溫保藏的洋蔥假單孢菌NTG-15-03接種至新配制的斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2d。將菌種反復活化3次后，置于冰箱中保藏。

1.3.3 乳糖酸的發(fā)酵

將活化好的種子培養(yǎng)液接種至含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，(30±1)℃恒溫振蕩培養(yǎng)96h。

1.3.4 乳糖酸含量的測定

采用HPLC法測定[6]，固定相：NH2P-50柱；檢測器：RID-10A示差折光檢測器；流動相：乙腈和40mmol/L Na2HPO4-20mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 5.0，體積比6:4，在0.8mL/min、40℃條件下泵入。

1.3.5 回歸正交試驗設計

中心組合試驗設計和結果分析方法：在Minitab 15軟件中，按照Minitab→統(tǒng)計→DOE→響應曲面→創(chuàng)建響應曲面設計→中心復合的順序，對以上4個因素進一步優(yōu)化，進行四因素三水平的31組中心組合設計試驗，設計試驗的中心編碼為0、0、0、0，試驗的實際濃度選取單因素試驗中乳糖酸產量最高的單因素數值，即種齡20h、接種量2%、pH7.0、培養(yǎng)時間96h。

按照確定的各因素編碼水平和試驗設計方法設計中心復合試驗，各因素編碼水平見表1。

表1 中心復合試驗的編碼及水平Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結果與分析

2.1 菌株種齡對乳糖酸產量的影響

將種齡分別為12、16、20、24、28h的菌株種子以2%的接種量接種至pH7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，4d后測定發(fā)酵液中乳糖酸的含量，結果見圖1。

圖1 菌株種齡對乳糖酸產量的影響Fig.1 Effect of seed age on the yield of lactobionic acid

由圖1可知，隨著種齡的增加，乳糖酸產量呈現出先升后降的趨勢。以種齡為20h的種子接種，發(fā)酵液中乳糖酸含量最高。

2.2 接種量對乳糖酸產量的影響

圖2 接種量對乳糖酸產量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of lactobionic acid

接種量的大小直接影響乳糖酸的發(fā)酵產量，合適的接種量不僅可以提高產物的合成速率，也有利于減少染菌機會。以種齡為20h細胞作為種子，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種至pH7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵4d，測定乳糖酸含量。由圖2可知，接種量為2%時發(fā)酵液中乳糖酸的產量最高；隨著接種量的增加乳糖酸的產量開始下降，這主要是由于過大的接種量使得菌體細胞的數量增殖過快，營養(yǎng)消耗過多，進而影響到代謝產物的生成量。

2.3 pH值對乳糖酸產量的影響

圖3 發(fā)酵液初始pH值對乳糖酸產量的影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on the yield of lactobionic acid

不同的發(fā)酵初始pH值不僅可以影響營養(yǎng)物質的可給性，同時也會影響代謝過程中酶的催化活性，進而影響到乳糖酸的產量。實驗以種齡為20h細胞作為種子，以2%的接種量接種至不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵4d，測定乳糖酸產量。由圖3可知，在發(fā)酵液初始pH值為7.0時，乳糖酸產量最高，因此確定該菌株的發(fā)酵初始pH值為7.0。

2.4 發(fā)酵時間對乳糖酸產量的影響

圖4 發(fā)酵時間對乳糖酸產量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of lactobionic acid

根據以上試驗對種齡、接種量、pH值分別選擇最優(yōu)值，其他條件保持不變，分別發(fā)酵4 8、7 2、9 6、120、144h考察發(fā)酵時間對乳糖酸產量的影響。由圖4可知，隨著時間的延長，乳糖酸產量增加，自96h以后，隨時間的延長，乳糖酸產量基本保持不變。

2.5 回歸正交試驗

2.5.1 中心復合試驗結果

表2 中心復合試驗結果Table 2 Central composite design matrix and results

利用Design Expert軟件對表2實驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得乳糖酸產量對pH值、種齡、接種量、發(fā)酵時間的二次多項回歸方程：

對二次多項回歸方程進行顯著性驗證和方差分析，結果見表3、4。

表3 二次模型中回歸系數的顯著性檢驗Table 3 Significance test of each regression coefficient in the established quadratic regression model

由表3可知，因素X3、X4、X32對乳糖酸產量的曲面效應影響極顯著，X2X4對乳糖酸產量的曲面效應影響顯著，其他對乳糖酸產量的影響不顯著。說明四因素均不同程度的對響應值產生顯著或極顯著的影響，原回歸方程可化簡為：

表4 中心復合試驗結果進行擬合的二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the yield of lactobionic acid under various fermentation conditions

由表4可知，模型回歸效果極顯著，多元相關系數為R2＝0.9574，說明該模型對實驗實際情況擬合較好，可用來進行響應值的預測，試驗設計方案正確。

2.5.2 回歸模型實驗驗證

經過實驗設計和結果分析得到優(yōu)化培養(yǎng)條件：菌株種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時間106h、pH7.0。在此培養(yǎng)條件下洋蔥假單胞菌發(fā)酵生產乳糖酸，得到的乳糖酸產量為10.08g/L，與模型預測值10.20g/L之間的誤差小于5%。

3 結 論

本實驗研究了發(fā)酵液初始pH值、接種量、種齡、發(fā)酵時間對洋蔥假單胞菌NTG-15-03菌株發(fā)酵生產乳糖酸產量的影響。單因素試驗和回歸正交設計試驗結果表明：在pH 7.0、種齡24h、接種量2%、發(fā)酵時間106h的條件下乳糖酸的產量為10.08g/L。

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Optimization of Fermentation Conditions for Lactobionic acid Production by Burkholderia cepacia

ZHENG Yan，KUANG Li-xue，LI Chao，ZHANG Yu-long*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The fermentation conditions of Burkholderia cepacia NTG-15-03 for the production of lactobionic acid were optimized using one-factor-at-a-time method and response surface analysis based on quadratic regression orthogonal design. The optimal fermentation conditions for the production of lactobionic acid were fermentation pH of 7.0, seed age of 24 h, inoculation amount of 2% and fermentation time of 106 h. Under these conditions, the yield of lactobionic acid was up to 10.08 g/L.

lactobionic acid；response surface analysis；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)11-0181-04

2011-05-15

鄭艷(1973—)，女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhengyan0403@163.com

*通信作者：張玉龍(1955—)，男，教授，博士，研究方向為農業(yè)資源利用。E-mail：ylzsau@163.com