王貴珍，董 昕，文連奎

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸關(guān)鍵酶的分離純化

王貴珍，董 昕，文連奎*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

為得到黑曲霉菌株F1中具有降酸作用的蛋白，將黑曲霉菌株F1經(jīng)酒石酸誘導(dǎo)發(fā)酵得到菌絲體，用液氮研磨破碎細(xì)胞壁，超聲波輔助提取得到粗酶液，硫酸魚精蛋白去除核酸，熱變除雜蛋白，聚乙二醇濃縮，透析脫鹽，DEAE-纖維素52陰離子交換層析，Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱分子篩層析，最終得到該蛋白的單一組分，其純化倍數(shù)為14.32，并確定該酶為脫氫酶類。

黑曲霉；酒石酸降解酶；分離純化

酒石酸(tartaric acid)，又名葡萄酸、二羥基琥珀酸，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，廣泛存在于高等植物中，葡萄和羅望子(酸角)中含量較高。山葡萄中酒石酸含量占總有機(jī)酸的60%以上，對(duì)山葡萄酒的口感和品質(zhì)具有較大影響[1-3]。在某些食品工廠廢液中也含有酒石酸，降解酒石酸對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)山葡萄酒、凈化含酒石酸的廢水有著非常重要的意義。

目前，降酸的方法主要有物理、化學(xué)和生物法[4-6]。而生物法降酸則主要集中在蘋果酸的降解方面[7-10]，生物降解酒石酸的報(bào)道很少。國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)了一種能降解酒石酸的假單胞菌微生物，并且對(duì)該過程中涉及到的一系列酶進(jìn)行了分離純化[11-12]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室從富含酒石酸的環(huán)境中篩選到一株能降解酒石酸的黑曲霉菌株F1，酒石酸降解率高達(dá)97%。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)其降解酒石酸的關(guān)鍵酶進(jìn)行分離純化，以探究其降酸的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

黑曲霉(Aspergillius niger)F1由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程實(shí)驗(yàn)室篩選，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(CGMCC5025)。

1.1.2 培養(yǎng)基

黑曲霉活化培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基):蔗糖30g、NaNO32g、K2HPO4·7H2O 1g、氯化鉀0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、瓊脂 15～20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:L(＋)酒石酸5g、K2HPO4·7H2O 1g、氯化鉀0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸餾水1000mL，pH3.0。

1.1.3 試劑

硫酸魚精蛋白(分析純)、NAD＋(分析純) 上海索寶生物科技有限公司進(jìn)口分裝； SephadexG-75、DEAE-cellulose 52 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；甲叉雙丙烯酰胺(電泳純)、考馬斯亮藍(lán)G-250、R-250(分析純)、牛血清白蛋白(分析純) 中國(guó)惠世生化試劑有限公司進(jìn)口分裝；四甲基乙二胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、β-巰基乙醇 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21LM型高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-D型微電腦全溫振蕩培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YC-2型層析實(shí)驗(yàn)冷柜、FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DW-F190-40℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；HD-2000型核酸蛋白檢測(cè)儀 上海嘉鵬科技有限公司；T6型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 菌種活化

將－40℃保藏的菌種解凍后轉(zhuǎn)接到察氏斜面培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)72h，進(jìn)行活化培養(yǎng)。

1.2.1.2 菌懸液制備

將斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的孢子輕輕刮下，懸浮到滅菌的生理鹽水中，置于搖床中振蕩打散。采用比濁法測(cè)定孢子數(shù)。

1.2.1.3 誘導(dǎo)產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)

在500mL三角瓶裝入200mL液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，接種黑曲霉孢子懸浮液，接種量1%，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，160r/min、32℃培養(yǎng)4d。

1.2.2 酒石酸降解酶的提取

粗酶液制備→硫酸魚精蛋白去除DNA→熱變→聚乙二醇濃縮→透析除鹽→DEAE纖維素52離子交換層析柱→SephadexG-75分子篩層析。其中每一步均測(cè)定酶活力和可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.1 菌絲體制備

將振蕩培養(yǎng)4d的黑曲霉細(xì)胞經(jīng)循環(huán)水式真空泵抽濾，用蒸餾水多次洗滌直至細(xì)胞表面無培養(yǎng)基殘留，收集菌絲體，備用。

1.2.2.2 細(xì)胞提取物的制備

取上述菌絲體50g，放入已事先預(yù)冷的研缽中，傾入液氮快速充分研碎細(xì)胞，加入0.1mol/L pH7.0 Tris-HCl緩沖溶液200mL，該緩沖溶液中含0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇，將細(xì)胞混合物置于冰水浴中，160W超聲40min(每隔30s超聲一次，每次超聲時(shí)間30s)，在4℃、10000r/min條件下離心30min[13]，棄去細(xì)胞碎片，得上清液，即為細(xì)胞提取物，記錄上清液體積。

1.2.2.3 去除核酸

取上述細(xì)胞提取物置于冰水浴中，邊攪拌邊緩慢加入0.1倍體積的質(zhì)量濃度為2g/100mL硫酸魚精蛋白[14]，在4℃、10000r/min離心30min，棄去沉淀，得上清液，記錄體積。

1.2.2.4 熱變?nèi)コs蛋白

將得到的上清液在53℃恒溫水浴鍋中保溫10min[15]，保溫過程中不斷緩慢攪拌，取出后迅速置于冰水浴中，冷卻一段時(shí)間，再4℃、10000r/min離心30min，棄去沉淀，得上清液，記錄體積。

1.2.2.5 硫酸銨分級(jí)沉淀

將含有5mmol/L β-巰基乙醇的飽和中性硫酸銨溶液加入上述得到的上清液中，兩者的體積比為1.4:1[16]，在冰水浴中邊攪拌邊加入，4℃靜置2h。4℃、10000r/min離心30min，棄去上清液，收集沉淀，將其再次溶解到少量體積0.05mol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，該緩沖溶液中含0.4mmol/L MnCl2和1mmol/L β-巰基乙醇。得到黑曲霉酒石酸降解酶的粗提液。

1.2.2.6 透析脫鹽、濃縮

將得到的粗酶液裝入事先處理好的透析袋中，置于500mL相同緩沖液中透析5h，每隔100min更換一次透析緩沖液；將經(jīng)透析后的粗酶液于－20℃預(yù)凍10h后置于冷凍干燥機(jī)中凍干，得黑曲霉酒石酸降解酶濃縮液。于－20℃保存，備用。

1.2.2.7 DEAE-纖維素52離子交換層析

將處理好的DEAE-纖維素52裝入離子交換層析柱中(1.5cm×28cm)，用0.05mol/L、pH7.0的緩沖液過夜平衡，平衡緩沖液中含有0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇。將得到的粗酶濃縮液上樣于平衡好的層析柱中，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的KCl平衡緩沖液配制溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速30mL/h，5mL/管進(jìn)行收集[17]。測(cè)定出峰部分各管在280nm波長(zhǎng)處吸光度和酶活力情況，合并有酶活力部分洗脫液，真空冷凍干燥濃縮。

1.2.2.8 Sephadex G-75凝膠層析

將溶脹好的Sephadex G-75葡聚糖凝膠灌入層析柱中(1.6cm×60cm)，用0.05mol/L、pH7.0的緩沖液過夜平衡，平衡緩沖液中含有0.4mmol/L MnCl2和5mmol/Lβ-巰基乙醇，用相同的緩沖溶液洗脫，流速12mL/h，5mL/管進(jìn)行收集[18]。測(cè)定出峰部分各管在280nm處吸光度和酶活力情況，合并有酶活力部分洗脫液，真空冷凍干燥濃縮。

1.2.3 分析測(cè)定

1.2.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[19]:配制一系列質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。

以標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)量濃度溶液對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A595nm＝0.0038ρ＋0.0064，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9982。式中:ρ為標(biāo)準(zhǔn)蛋白液質(zhì)量濃度(μg/mL)，質(zhì)量濃度范圍為0～100μg/mL。

1.2.3.2 酶活力測(cè)定

[20]，所獲得的降解酒石酸的蛋白酶為酒石酸脫氫酶類，該種酶類需要有NAD＋作為輔酶來實(shí)現(xiàn)對(duì)酒石酸的催化降解作用，其反應(yīng)機(jī)理如下:

L(＋)酒石酸＋NAD＋草酸乙醇酸＋NADH＋H+

由上式可知，當(dāng)有過量底物存在時(shí)，NAD+被還原的速度與酶活力成正比，酶活力越高，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的NADH就越多。NADH對(duì)340nm紫外線有較強(qiáng)吸收，NAD＋則無此能力，因此可通過測(cè)定反應(yīng)體系在340nm處吸光度的變化來反映NADH的生成量，從而表示酶活力的大小。25℃條件下，每分鐘催化1μmol NAD＋轉(zhuǎn)化為NADH所消耗的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，即IU。

酶活力反應(yīng)體系包括:0.2mol/L Tris-HCl、pH8.6、1mmol/L β-巰基乙醇、0.4mmol/L MnCl2、10mmol/L L(＋)酒石酸、2mmol/L NAD＋。25℃條件下，向該酶活反應(yīng)體系中加入適量酶，在340nm波長(zhǎng)處每隔30s測(cè)定一次吸光度。并以蒸餾水代替底物，做空白實(shí)驗(yàn)。

為了證明所獲得的目的蛋白是否為脫氫酶類:分別在該酶中不添加NAD＋和添加NAD+，于340nm波長(zhǎng)處每隔30s測(cè)定一次吸光度，檢測(cè)兩種情況下是否有酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶液的獲得

菌絲體經(jīng)破碎，超聲輔助提取獲得的粗酶液中含有一定量的蛋白，說明所要提取的目的蛋白存在于粗酶液中。

2.2 熱變?nèi)コs蛋白結(jié)果

熱變之后，酶活力14.14IU，總蛋白、總酶活力都有所下降，酶比活力上升，熱變除去了一部分小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，目的蛋白也有一定損失，造成酶活降低。

2.3 DEAE-纖維素52離子交換層析

圖1 DEAE-纖維素52離子交換層析結(jié)果Fig.1 Elution profile of crude enzyme on DEAE-52 column

由圖1可知，經(jīng)DEAE-纖維素52洗脫主要得到4個(gè)蛋白峰，1個(gè)主蛋白峰(99～123mL處)和3個(gè)小蛋白峰(35～63mL、63～75mL、135～147mL處)，分別收集4種不同組分，逐管測(cè)定酶活力情況，發(fā)現(xiàn)酶活力峰與主蛋白峰基本重合，但是主蛋白峰前面有一較小雜蛋白峰，說明這兩種蛋白離子強(qiáng)度相近，仍需進(jìn)一步分離，收集主蛋白峰部分樣液，真空冷凍干燥凍干，于－20℃保存，備用。

2.4 Sephadex G-75凝膠層析結(jié)果

圖2 Sephadex G-75凝膠層析結(jié)果Fig.2 Elution profile of on partially purified enzyme on Sephadex G-75 column

由圖2可知，樣液經(jīng)過Sephadex G-75凝膠柱后，主要獲得2個(gè)蛋白峰(27～39 mL、54～90mL處)，分別收集這2個(gè)蛋白峰樣液，逐管測(cè)定酶活力，從54mL時(shí)開始出現(xiàn)酶活力，90mL時(shí)酶活力消失，酶活力峰與主蛋白峰重合。另外，2個(gè)蛋白峰有一定距離，由于Sephadex G-75凝膠是根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的，那么圖中兩種蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小有一定差異。所以此方法能夠較好分離目的蛋白與雜蛋白。收集主蛋白峰部分樣液，真空冷凍干燥，－20℃保存，備用。

2.5 不同方法所測(cè)酶活力結(jié)果

表1 添加NAD+和不添加NAD+的酶活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results obtained for determination of enzyme activity in the presence and absence of NAD+

從表1可以看出，不添加NAD＋的一組實(shí)驗(yàn)中吸光度沒有變化，表示沒有酶活力，而添加了NAD＋的一組實(shí)驗(yàn)中吸光度逐漸變大，說明生成了NADH，表示有酶活力。NAD＋是脫氫酶的輔酶，催化脫氫酶脫去氫而本身被還原為NADH，表明獲得的目的蛋白酶為脫氫酶。

2.6 酶的分離純化結(jié)果

為得到可降解酒石酸的酶，進(jìn)行了細(xì)胞破碎、熱變、DEAE-纖維素52層析、Sephadex G-75凝膠層析等純化步驟。收集各純化步驟得到的上清液，分別測(cè)定其總蛋白含量、酶總活力、酶比活力，結(jié)果見表2。

表2 黑曲霉中酒石酸降解酶的分離純化Table 2 Purification of tartaric acid degrading enzymes from Aspergillus niger

由表2可知，黑曲霉菌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞破碎、熱變、離子交換層析、葡聚糖分子篩層析后，總蛋白含量變?yōu)?.61mg，表明細(xì)胞里的雜蛋白被除去，同時(shí)可降解酒石酸的酶也有損耗；酶總活力變?yōu)?57.5IU表明可降解酒石酸的酶在提純過程中有損失；酶比活力變?yōu)?89.69IU/mg，表明經(jīng)過一系列純化步驟，獲得了可降解酒石酸的酶，最終得率為28.63%，純化倍數(shù)為14.32。

3 結(jié) 論

經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)酶、液氮破碎、超聲輔助提取、硫酸魚精蛋白去除核酸、熱變除雜蛋白、DEAE-纖維素52離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析等一系列分離純化手段，最終獲得了黑曲霉降酸菌株F1降解酒石酸目的蛋白酶的單一組分，冷凍干燥之后為白色粉末，最終純化倍數(shù)為14.32，該酶在有NAD+存在的條件下才有降解酒石酸的作用，因此確定了該酶屬于脫氫酶類。

參考文獻(xiàn):

[1]高年發(fā), 李小剛, 楊楓. 葡萄及葡萄酒中的有機(jī)酸及降酸研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 1999(4): 6.

[2]王華, 張春暉, 李華. 乳酸菌在葡萄酒釀造中的應(yīng)用[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 24(6): 92-98.

[3]李華. 現(xiàn)代葡萄酒工藝學(xué)[M]. 西安: 陜西人民出版社, 1995.

[4]康孟利, 凌建剛, 林旭東. 果酒降酸方法的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008(24): 26-27; 31.

[5]文連奎, 趙薇, 張微, 胡耀輝. 果酒降酸技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(11): 325-328.

[6]呂會(huì)娟, 逄森貴, 閆玉亮. 山葡萄酒降酸新工藝研究[J]. 釀酒工藝, 2008(21): 42-43.

[7]張春暉, 夏雙梅, 莫海珍. 微生物降酸技術(shù)在葡萄酒釀造中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技, 2000(2): 56-58; 60.

[8]高年發(fā), 王淑豪, 李曉剛, 等. 釀酒酵母與粟酒裂殖酵母屬間原生質(zhì)體融合選育降解蘋果酸強(qiáng)的葡萄酒酵母[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2000, 16 (6): 718-722.

[9]張春暉, 夏雙梅, 張家翔. 生物工程技術(shù)在蘋果酸-乳酸發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技, 2002(5): 51-54.

[10]丁正國(guó). 葡萄酒蘋果酸: 乳酸發(fā)酵的理論與實(shí)踐[J]. 中國(guó)釀造, 1995 (5): 10-15.

[11]KOHN L D, TRUDGILL P W. Tartaric acid metabolism Ⅲ. The formation of glyceric acid[J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 2465-2471.

[12]KOHN L D, TRUDGILL P W. Tartaric acid metabolism Ⅳ. Crytalline L-malic dehydofenase from Pseudomonas acidovoran sp. [J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 2472-2478.

[13]KOHN L D, PACKMAN P M, ALLEN R H, et al. Tartaric acid metabolism Ⅴ. Crystalline tartrate dehydrogenase[J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 2479-2485.

[14]KOHN L D, JAKOBY W B. Tartaric acid metabolism Ⅵ. Crystalline oxaloglycolate reductive decarboxylase[J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 2486-2493.

[15]KOHN L D, JAKOBY W B. Tartaric acid metabolism Ⅶ. Crystalline hydroxypyruvate reductase[J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 2472-2478.

[16]KOHN L D. Tartaric acid metabolism Ⅷ. Crystalline tartroniase mialdehydereductase[J]. J Bio Chem, 1968, 243(10): 4426-4433.

[17]舒正玉, 楊江科, 閆云君. 黑曲霉F044脂肪酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(1): 96-100.

[18]趙林果, 夏文靜, 游麗金, 等. 黑曲霉胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶分離提純及其性質(zhì)的研究[J]. 現(xiàn)代化工, 2008, 28(10): 38-42.

[19]陳均輝, 陶力, 李俊, 等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2003: 63-64.

[20]GIFFHORN F, KUHN A. Purificationand characterizationofa bifunctional. L-(+)tartrate dehydrogenase D-(+)malate dehydrogenase (decarboxylating) from Rhodopseudomonas sphaerodies Y.[J]. J Bacteriology, 1983, 155: 281-290.

Isolation and Purification of Key Tartaric Acid Degrading Enzyme from Aspergillus niger F1

WANG Gui-zhen，DONG Xin，WEN Lian-kui*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The purpose of this study was to prepare a key tartaric acid degrading enzyme from Aspergillus niger F1. Aspergillus niger F1 was cultured and the expression of tartaric acid degrading enzymes was induced by adding tartaric acid into the medium. Cultured mycelia of Aspergillus niger F1 were collected and homogenized in liquid nitrogen. Crude enzyme extract was obtained by ultrasonic assisted extraction, added with protamine sulfate for removing nucleic acids, denatured for removing unwanted proteins, concentrated by PEG treatment, dialyzed for desalting, and then purified by DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography to obtain a single component with a purification factor of 14.32. The enzyme was proven to be a dehydrogenase.

Aspergillus niger；tartaric acid degrading enzymes；separation and purification

Q519

A

1002-6630(2012)15-0235-04

2011-09-23

吉林省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20090228)

王貴珍(1983—)，女，碩士，主要從事食品微生物及生物技術(shù)研究。E-mail:wangguizhen510@126.com

*通信作者:文連奎(1962—)，男，教授，博士，主要從事長(zhǎng)白山野生資源的開發(fā)利用研究。E-mail:wenliankui@163.com