謝 靜，熊善柏，曾令彬，趙思明*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，湖北 武漢 430070)

分離自臘魚的乳酸菌生長及產(chǎn)酸特性

謝 靜，熊善柏，曾令彬，趙思明*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北省水產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，湖北 武漢 430070)

采用Gompertz模型擬合從臘魚中分離的5株乳酸菌的生長和產(chǎn)酸曲線，分析其生長和產(chǎn)酸特性。結(jié)果表明：Gompertz模型對乳酸菌的生長和產(chǎn)酸曲線的擬合精度很高；在生長模型和產(chǎn)酸模型中，5株乳酸菌生長的早期適應(yīng)性相似，其中乳酸片球菌和食品乳桿菌的生長速率(0.32h-1)和產(chǎn)酸速率(0.32h-1)高于其他菌株；在生長模型中兩者平衡菌數(shù)最高(分別為2.48和2.49)；在產(chǎn)酸模型中兩者平衡pH值最低(都為3.76)；乳酸菌培養(yǎng)液的pH值與總菌數(shù)OD600nm值顯著線性負(fù)相關(guān)。

乳酸菌；Gompertz模型；生長曲線；產(chǎn)酸曲線

臘魚一般是以淡水魚為原料，用食鹽和香辛料在低溫條件下腌制，經(jīng)自然或人工干燥而成。葡萄球菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等微生物是臘制品中常見的微生物[1]，乳酸菌是臘魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌[2]，對發(fā)酵魚風(fēng)味和優(yōu)良品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用[3]。

微生物的生長曲線能夠反映其生長規(guī)律和特性，對比較不同微生物的特性和預(yù)測食品貨架期具有指導(dǎo)作用。微生物的生長模型有多種，修正的Gompertz模型和Logistic模型被廣泛應(yīng)用于食品中微生物生長曲線的模擬[4-5]，其中Gompertz模型更適合于乳酸菌的擬合[6]。由于乳酸菌的來源不同，其生長特性存在一定的差異[7]。作為臘魚發(fā)酵劑的優(yōu)良菌種，應(yīng)該生長旺盛和具有一定的產(chǎn)酸能力，從而縮短生產(chǎn)時間、改善產(chǎn)品風(fēng)味和抑制腐敗菌生長[8]。本實(shí)驗(yàn)采用Gompertz模型，擬合本研究室從臘魚制作過程中分離鑒定的5株乳酸菌的生長和產(chǎn)酸曲線，分析不同乳酸菌的生長和產(chǎn)酸特性，以期為篩選適合臘魚加工的優(yōu)良菌種提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與儀器

乳酸菌：植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、食品乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、乳酸片球菌(Pediococcus acidiactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，本研究室分離自臘魚加工過程的魚肉中[8]。

MRS液體培養(yǎng)基[8]，用于乳酸菌的培養(yǎng)。

DL-CJ-1N 型超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司； 722S 型分光光度計、PHS-3D型 pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HN303型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱南通滬南科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

乳酸菌生長曲線的測定采用比濁法。將保藏在-18℃冰箱中的菌株轉(zhuǎn)接到已滅菌的9mL液體MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h，連續(xù)進(jìn)行3次活化，得到活化的乳酸菌的培養(yǎng)液。取1mL培養(yǎng)18h的乳酸菌培養(yǎng)液，接種于200mL MRS液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)36h。培養(yǎng)期間每隔2h取樣一次，以不接種的MRS液體培養(yǎng)基作空白，用分光光度計測定培養(yǎng)液的光密度OD值[9]，測定波長為600nm，用OD600nm值表示總菌數(shù)。用pH計測定上述不同培養(yǎng)時間取樣的培養(yǎng)液的pH值，乳酸菌的產(chǎn)酸量用pH值表示[10]。

1.2.2 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的擬合

根據(jù)乳酸菌的OD值和pH值隨時間變化時的散點(diǎn)分布，采用Gompertz方程[11]擬合乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線。Gompertz方程如下：

式中：N為培養(yǎng)時間t時的總菌數(shù)，用OD值表示；N0、 b0與初始菌數(shù)和平衡菌數(shù)相關(guān)的參數(shù)，當(dāng)t＝0時，初始菌數(shù)Nt＝0＝N0+b0e-b1，當(dāng)t→+∞時，平衡菌數(shù)Nt=+∞＝N0+b0；b1為反應(yīng)早期適應(yīng)性的常數(shù)，b1越大早期適應(yīng)性越差；b2為生長速率常數(shù)/h-1，b2越大生長越快。

式中：P為培養(yǎng)時間t時的產(chǎn)酸總量，用pH值表示；P0、b0與初始pH值和平衡pH值相關(guān)的參數(shù)，當(dāng)t＝0時，初始pH值Pt＝0＝P0+m0e-m1，當(dāng)t→+∞時，平衡pH值Pt=+∞=P0+m0；m1反應(yīng)早期適應(yīng)性的常數(shù)；m2為產(chǎn)酸速率常數(shù)/h-1，m1越大產(chǎn)酸越快。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003繪圖，采用SAS 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。所有數(shù)據(jù)平行測定3次，回歸分析中參數(shù)的計算采用最小二乘法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

由圖1可知，5株乳酸菌的生長都經(jīng)歷了延緩期、快速生長期和穩(wěn)定期，接種后5～15h內(nèi)OD值增加最快，20h后各菌株都進(jìn)入穩(wěn)定期，但不同菌株的生長速率和平衡菌數(shù)不同，其中食品乳桿菌和乳酸片球菌生長最旺盛，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌次之，戊糖片球菌生長最慢，平衡菌數(shù)高低順序與生長速度順序一致。

圖1 乳酸菌在30℃的生長曲線Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria ( 30 ℃)

Gompertz生長模型中參數(shù)的值見表1。5株乳酸菌剩余平方和(SSE)都小于回歸平方和(SSR)，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99，表明用Gompertz模型擬合乳酸菌的生長曲線具有很高的精度。生長模型中b1反映了乳酸菌早期的生長適應(yīng)性，b2是反映生長速率的參數(shù)，兩者能夠較好反應(yīng)微生物的生長特性[9]。5株乳酸菌的b1相互接近，表明各乳酸菌的早期適應(yīng)性相似。食品乳桿菌和乳酸片球菌的生長速率常數(shù)b2最大，且兩者的數(shù)值相近，表明其生長最快，其次是植物乳桿菌和彎曲乳桿菌，戊糖片球菌最小。乳酸菌平衡菌數(shù)N0＋b0從大到小依次是食品乳桿菌、乳酸片球菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌和戊糖片球菌，與生長速率常數(shù)的規(guī)律一致。生長速率越大，平衡菌數(shù)越大，表明最終的菌數(shù)取決于生長速率。這一結(jié)論與Katarzyna[13]和Wachenheim[14]相似，他們在研究發(fā)酵肉制品中微生物和批量培養(yǎng)的微生物的生長模型時發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)充足的條件下，平衡菌數(shù)主要與微生物的生長速率相關(guān)。

表1 乳酸菌生長模型中的參數(shù)Table 1 Parameters in the growth model for lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

乳酸菌能夠分解原料中的碳水化合物，產(chǎn)生的乳酸使原料的pH值下降，不僅可以抑制有害微生物的生長[15]，還可以賦予臘魚柔和的香氣。由圖2可知，在培養(yǎng)過程中，0～5h內(nèi)乳酸菌培養(yǎng)液的pH值變化緩慢，5～15h內(nèi)快速下降，20h以后穩(wěn)定，但不同菌株pH值的下降速度和平衡時pH值不同。比較圖1與圖2，pH值與OD600nm值的變化都經(jīng)歷了延緩期、快速變化期和穩(wěn)定期，且不同時期經(jīng)歷的時間也大致相同；隨著培養(yǎng)時間的延長，菌液pH值的下降，乳酸菌的生長逐漸受到抑制，總菌數(shù)OD600nm值趨于平衡。

圖2 乳酸菌在30℃的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid-producing curve of lactic acid bacteria (30 ℃)

采用Gompertz模型擬合的產(chǎn)酸曲線，模型中各參數(shù)的值見表2。從回歸分析的回歸平方和(SSR)、 剩余平方和(SSE)和相關(guān)系數(shù)(R2)的值可以看出，用Gompertz模型擬合的5株乳酸菌的產(chǎn)酸曲線，均有較高精度。Gompertz產(chǎn)酸模型中產(chǎn)酸速率常數(shù)(m2)從大到小依次是乳酸片球菌(食品乳桿菌)、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌和戊糖片球菌，其中戊糖片球菌的產(chǎn)酸速率常數(shù)顯著低于其他乳酸菌；平衡時戊糖片球菌的培養(yǎng)液的pH值下降至4.23，其他乳酸菌的pH值可降至3.8，表明戊糖片球菌的耐酸能力最低。

表2 乳酸菌產(chǎn)酸模型中的參數(shù)Table 2 Parameters in the pH model for lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌培養(yǎng)液pH值與OD600nm值的相關(guān)性

圖3 乳酸菌培養(yǎng)液pH值與OD600nm值的相關(guān)性Fig.3 Correlation of pH and OD600nm

圖3 為乳酸菌培養(yǎng)液的pH值與OD600nm值的關(guān)系圖。根據(jù)數(shù)據(jù)的分布規(guī)律，采用方程式(3)描述p H值與OD600nm值的關(guān)系。

式中：斜率k的絕對值表示單位數(shù)量乳酸菌的產(chǎn)酸量；b為培養(yǎng)基的初始pH值，本實(shí)驗(yàn)為6.2。

式(3)中的參數(shù)見表3。相關(guān)系數(shù)均大于0.95，表明乳酸菌培養(yǎng)液pH值與總菌數(shù)顯著線性負(fù)相關(guān)，式(3)的擬合精度很高。彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、食品乳桿菌、乳酸片求菌的k值接近，戊糖片球菌k的絕對值最高，表明單位數(shù)量戊糖片球菌的產(chǎn)酸量最高。雖然戊糖片球菌單位數(shù)量菌體的產(chǎn)酸量高，但由于其生長速率較慢，平衡菌數(shù)較少，因此達(dá)到平衡時pH值較高。

表3 pH值乳酸菌培養(yǎng)液OD值直線方程的各參數(shù)Table 3 Parameters in the linear equation

3 結(jié) 論

Gompertz模型對植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、食品乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌的生長和產(chǎn)酸曲線具有很高的擬合精度，生長曲線和pH值曲線都經(jīng)歷了延緩期、快速變化期和穩(wěn)定期。5株乳酸菌生長的早期適應(yīng)性相似，其中乳酸片球菌和食品乳桿菌的生長速率常數(shù)和產(chǎn)酸速率常數(shù)最大，生長和產(chǎn)酸最快，平衡菌數(shù)最高，平衡pH值最低。方程pH＝b＋kOD600nm對pH值與總菌數(shù)的關(guān)系具有較高的擬合精度，pH值與總菌數(shù)OD600nm顯著線性負(fù)相關(guān)。

[1]曾令彬, 熊善柏, 王莉. 臘魚加工過程中微生物及理化特性的變化[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(3): 54-57.

[2]曾令彬, 譚汝成, 熊善柏, 等. 臘魚加工中優(yōu)勢乳酸菌的分離與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(1): 115-116; 119.

[3]SANNI A I, ASIEDU M, AYERNOR G S. Microflora and chemical composition of Momoni, a Ghanaian fermented fish condiment[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2002, 15(5): 577-583.

[4]CHOWDHURY B R, CHAKRABORTY R, CHAUDHURI U R. Validity of modified Gompertz and Logistic models in predicting cell growth of Pediococcus acidilactici H during the production of bacteriocin pediocin AcH[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 80(4): 1171-1175.

[5]CAYRE M E, VIGNOLOB G, GARRO O. Modeling lactic acid bacteria growth in vacuum-packaged cooked meat emulsions stored at three temperatures[J]. Food Microbiology, 2003, 50(5): 561-566.

[6]SLONGO A P, ROSENTHAL A, CAMARGO L M Q, et al. Modeling the growth of lactic acid bacteria in sliced ham processed by high hydrostatic pressure[J]. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42 (1): 303-306.

[7]吳祖興, 張華. 發(fā)酵肉制品乳酸菌菌種篩選研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(9): 47-49.

[8]謝靜, 熊善柏, 曾令彬, 等. 臘魚加工中的乳酸菌及其特性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(6): 32-36.

[9]牛天貴. 食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002.

[10]曾令彬. 臘魚加工中微生物菌群、理化特性及揮發(fā)性成分的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[11]CHIU Y S, ZAJIC J E. Gompertz,s law on the growth of mycelial pellets [J]. Biotechnology and Bioengineering, 1976, 18(8): 1167-1170.

[12]趙思明. 食品科學(xué)與工程中的計算機(jī)應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

[13]KATARZYNA K, DANUTA K K. Construction of predictive models of growth of microorganisms in salted and cured meat products[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2006, 7(1/2): 152-159.

[14]WACHENHEIM D E, PATTERSON J A, LADISCH M R. Analysis of the logistic function model: derivation and applications specific to batch cultured microorganisms[J]. Bioresource Technology, 2003, 86(2): 157-164.

[15]FRANCESCA V, PALMRIA D B, STELLA L L, et al. Use of Lactobacillus plantarum fermentation products in bread-making to prevent Bacillus subtilis ropy spoilage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 122(3): 328-332.

Growth and Acid-Producing Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Cured Fish

XIE Jing，XIONG Shan-bai，ZENG Ling-bin，ZHAO Si-ming*
(Aquatic Product Engineering and Technology Research Center of Hubei Province, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Gompertz model was applied to fit the curves of growth and pH of five lactic acid bacterial strains isolated from cured fish with the purpose of analyzing the growth and acid-producing properties of lactic acid bacteria. The results indicated that Gompertz model could fit the growth and pH curves with high accuracy. Five lactic acid bacterial strains presented similar adaptability in the lag phase. The growth rates and acid productivities of Pediococcus acidilactici and Lactobacillus alimentarius were much higher than those of other strains. Meanwhile, both strains revealed the highest balanced total bacterial count and lowest balanced pH. Moreover, a significant correlation between the pH of the culture medium and total lactic acid bacteria count was observed.

lactic acid bacteria；Gompertz model；growth curve；acid-producing curve

TS254.4

A

1002-6630(2012)11-0147-04

2011-06-13

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46-23)

謝靜(1987—)，女，碩士研究生，主要從事食品工藝研究。E-mail：student921129@163.com

*通信作者：趙思明(1963—)，女，教授，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏、食品大分子結(jié)構(gòu)及功能特性研究。E-mail：zsmjx@mail.hzau.edu.cn