李 帥，趙巖巖，陳曉平

響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化

李 帥，趙巖巖，陳曉平*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

對蜂膠中黃酮類化合物提取工藝條件進行優(yōu)化。采用單因素試驗分析微波時間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時間、液料比6個因素對總黃酮得率影響，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法進行響應(yīng)面試驗，并對各個因素的顯著性和交互作用進行分析。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為微波時間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃、浸提時間12h、液料比25∶1(mL/g)，在此條件下，蜂膠總黃酮得率為25.08%。

蜂膠；總黃酮；提??；響應(yīng)面分析法

蜂膠是蜜蜂從植物樹芽、花苞和樹干處采集的樹膠，并混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。蜂膠有“黃酮化合物寶庫”之稱，其主要活性成分包括黃酮類、萜烯類、有機酸、芳香醛、酯類及多種氨基酸、酶、維生素、礦物質(zhì)等[2-4]。具有抗真菌，抗病毒和抗腫瘤特性[5]。本實驗采用微波法對蜂膠中總黃酮進行提取并測定提取液中總黃酮含量，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波法提取蜂膠中總黃酮的工藝條件。旨在為蜂膠黃酮的開發(fā)利用提供進一步的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

粗蜂膠 吉林市毛氏蜜蜂養(yǎng)殖廠。

蘆丁(AR) 天津天一方科技有限公司；無水乙醇(AR) 北京化工廠；硝酸鋁 中國上海新星精細化工廠；氫氧化鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉 萊陽化工實驗廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電子恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；LG-10-2.4A高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；A-20組織粉碎機 金壇市科析儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)篩(60目) 浙江上虞市道墟儀器篩具廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

粗蜂膠置于－20℃冷凍5h，粉碎過60目篩，石油醚回流提取3h脫蠟[6-7]。

1.2.2 總黃酮提取的工藝流程

將預(yù)處理后的蜂膠進行微波處理，微波一段時間后用乙醇浸泡一定時間，提取液離心取上清液用乙醇定容至25mL，得蜂膠黃酮樣品溶液[8-9]。

1.2.3 黃酮的測定與計算[10]

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制一定濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，測定波長510nm處吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A＝0.014C＋0.0024，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9996，說明蜂膠中總黃酮在所提取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度和吸光度成良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 總黃酮含量的測定

吸取0.1mL提取液于10mL容量瓶中，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法配制溶液，以空白試劑為參比液調(diào)零，測其吸光度記為A，測3次取平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得提取液質(zhì)量濃度C/(μg/mL)，按下式計算蜂膠中黃酮得率(X)。

式中：C為樣液質(zhì)量濃度/(μg/mL)；V0為定容后的體積/mL；V1為樣液體積/mL；V2為稀釋體積/mL；m為稱取蜂膠質(zhì)量/g。

1.2.3.3 單因素試驗

在試驗條件：液料比20∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間4h、提取溫度40℃、微波功率240W、微波時間60s不變的情況下，進行單因素試驗，參考各因素對蜂膠總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計[11-13]

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝條件。綜合單因素試驗結(jié)果，選取微波時間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度4個因素，利用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計進行多元回歸分析[14-15]。試驗方案及結(jié)果見表1。

表1 微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波時間對蜂膠中總黃酮得率的影響

圖1 微波時間對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，隨著微波時間的延長，蜂膠中總黃酮得率先增加后減少。在60s達到最大，隨著時間的延長，蜂膠中總黃酮的得率逐漸減少。這可能是因為過長的微波時間會導(dǎo)致蜂膠膠質(zhì)的變化。

2.1.2 微波功率對蜂膠中總黃酮得率的影響

圖2 微波功率對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，微波功率對得率影響較大，隨著微波功率的增加，蜂膠中總黃酮得率先增加后減少，當(dāng)微波功率達到240W時蜂膠中總黃酮得率達到最大值，隨后微波功率增加總黃酮得率開始減少，這可能是因為在較大的微波功率下部分黃酮被分解的原因。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蜂膠中總黃酮得率的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蜂膠總黃酮得率逐漸增加。這可能是因為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，一些醇溶性雜質(zhì)、色素等的浸出量也有所增加，從而影響了總黃酮得率。

2.1.4 乙醇提取溫度對蜂膠中總黃酮得率的影響

圖6 液料比對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of solvent-to-solid on extraction rate of flavonoids

圖4 提取溫度對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著提取溫度的增加蜂膠總黃酮提取率逐漸增加。這可能是因為隨著溫度的升高，分子運動速度加快，滲透和擴散作用加強，使蜂膠中總黃酮更易于溶出。

2.1.5 提取時間對蜂膠中總黃酮得率的影響

圖5 乙醇提取時間對蜂膠中總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time of on extraction rate of flavonoids

由圖5可以看出，隨著乙醇提取時間的增加，蜂膠總黃酮得率逐漸升高，這可能是因為提取時間越長蜂膠黃酮的溶出量越大。確定最佳提取時間為12h。

2.1.6 液料比對蜂膠中總黃酮得率的影響

由圖6可以看出，隨著液料比的增加，蜂膠中總黃酮得率有所增加，但增加并不明顯，再增加液料比蜂膠中總黃酮得率趨于穩(wěn)定?？梢钥闯鲆毫媳葹?5∶1時蜂膠中總黃酮已基本溶出。由于過大的液料比會造成溶劑和能源的浪費，從浸提效果和經(jīng)濟兩方面綜合考慮，確定最佳料液比為25∶1(mL/g)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠中總黃酮提取工藝參數(shù)

2.2.1 回歸方程的建立與分析

本試驗共有29個試驗點，其中1～24號為析因試驗，25～29號為中心試驗，用來估計試驗誤差。試驗方案及結(jié)果見表2。利用Design-Expert 7.0軟件對表2結(jié)果進行統(tǒng)計分析，可建立如下二次回歸方程：

表2 微波輔助乙醇提取蜂膠黃酮工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

其中二次多項式的相關(guān)系數(shù)R2＝95.12%、＝90.23%、＝71.87%。與值在一致性上是合理的。所以此模型能被用來指導(dǎo)設(shè)計響應(yīng)面。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

對二次回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可知，回歸模型達到極顯著水平(P＜0.01)，而誤差項不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合得較好，試驗誤差小。因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析?；貧w系數(shù)R2＝0.9512＞0.9，表明該模型相關(guān)度好。回歸模型各項的方差分析還表明，一次項、二次項、交互項都有較顯著影響，所以響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系?；貧w模型中作用顯著項是X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42。從各變量顯著性檢驗P值的大小，可以看出影響蜂膠黃酮提取效果的各因素按大小排序依次為提取溫度＞微波時間＞微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果

為了考察交互項對蜂膠中黃酮效果的影響，在兩個因素條件固定不變的情況下，考察交互項對蜂膠中黃酮提取效果的影響，對模型進行降維分析。經(jīng)響應(yīng)面7.0軟件分析，所得響應(yīng)面及其等高線見圖7。由圖7可知，兩因素交互作用由大到小為：微波時間和微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度＞微波時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時間和提取溫度。

圖7 各兩因素交互作用對蜂膠總黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

2.2.3 浸提法提取蜂膠黃酮工藝的優(yōu)化與驗證結(jié)果

為進一步確定工藝最佳點，用Design-Expert 7.0軟件進行數(shù)值優(yōu)化分析，以獲得最優(yōu)的浸提條件。經(jīng)分析，最適條件值分別為微波時間69.19s、微波功率282.33W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.87%、提取溫度77.06℃，在此條件下蜂膠中黃酮得率為25.41%?？紤]到實際工作的便利，將浸提工藝修正為微波時間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃。采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行驗證實驗，試驗結(jié)果測得蜂膠黃酮提取率25.08%，與模型預(yù)測值相差不大。證明該模型具有一定的可靠性。

3 結(jié) 論

采用浸提技術(shù)對蜂膠中總黃酮進行提取，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析對浸提工藝進行優(yōu)化，對微波時間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度進行方差分析。結(jié)果表明微波時間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度對蜂膠黃酮得率有顯著影響。模型擬合程度高，試驗誤差小。

利用響應(yīng)面方法結(jié)合實際可操作性得出最佳工藝條件為微波時間70s、微波功率282W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度77℃，該條件下的蜂膠黃酮提取率為25.08%，與模型預(yù)測值25.41%相差較小，表明將響應(yīng)面設(shè)計引用到蜂膠黃酮提取工藝中可行，結(jié)果可靠。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Propolis by Response Surface Methodology

LI Shuai，ZHAO Yan-yan，CHEN Xiao-ping*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

This paper reports the optimization of process conditions for microwave-assisted extraction of flavonoids from propolis using response surface methodology. The effects of six operating parameters including microwave treatment time, microwave power, solvent composition (ethanol concentration), temperature, time and solvent-to-solid on total flavonoid yield were investigated through one-factor-at-a-time experiments. The significance and interaction effects of microwave treatment time, microwave power, ethanol concentration and temperature were analyzed by response surface analysis based on a threelevel central composite design. The optimal microwave-assisted extraction conditions for total flavonoids were determined as follows∶ 70 s microwave treatment at 282 W followed by extraction with 80% ethanol aqueous solution at a solvent-to-solid of 25 mL/g and 77 ℃ for 12 h. Under these conditions, the yield of total flavonoids from propolis was up to 25.08%.

propolis；flavonoids；extraction；response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630(2012)18-0127-06

2011-07-16

李帥(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物化學(xué)與功能食品。E-mail：huajiyuji1986@163.com

*通信作者：陳曉平(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物化學(xué)與功能食品。E-mail：XP63@Tom.com