幸思忠 薛冀蘇 李鶴平 賴伏虎 黃呈輝 曾志榮 楊建勇 龍健婷

肝癌為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，且發(fā)病率有上升趨勢(shì)。肝癌的免疫治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱門(mén)課題。在我國(guó)，肝癌的發(fā)生與HBV感染密切相關(guān)，相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清乙肝表面抗原（HBsAg）檢出率高達(dá)90%以上，提示HBsAg是肝癌的重要相關(guān)抗原之一。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）瘤苗對(duì)肝癌荷瘤小鼠產(chǎn)生有較明顯的免疫治療作用，同時(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的抗肝癌免疫保護(hù)作用。但這種特異性的CTL效應(yīng)還不夠理想，如何提高DC提呈抗原能力，成為進(jìn)一步誘導(dǎo)的特異性CTL的關(guān)鍵。已有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-70(HSP70)參與抗原提呈加工、協(xié)同免疫及自身免疫，可能是一種理想的疫苗增效劑［1］。本研究以HepG222.1.5肝癌細(xì)胞負(fù)荷小鼠模型，通過(guò)HSP70-HBsAg嵌合基因的重組腺病毒載體（Ad-HSP70-HBsAg）的介導(dǎo)，探討HSP70-HBsAg嵌合基因修飾DC瘤苗對(duì)肝癌動(dòng)物模型的免疫治療效果，以期為HSP70-HBsAg嵌合基因修飾DC瘤苗治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株

C57BL／6J小鼠，雌性，6～8周齡，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HepG222.1.5細(xì)胞系為整合HBV基因的肝癌細(xì)胞系，能夠穩(wěn)定表達(dá)HBsAg和分泌HBV DNA，由南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院感染科惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白介素-4（rmIL-4）、重組小鼠白介素-2（rmIL-2）和重組小鼠腫瘤壞死因子（rmTNF-α）購(gòu)自深圳晶美公司。 RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶消化液和青霉素/鏈霉素購(gòu)自Life Technologies公司。絲裂霉素C（Mitomycin C）、G418、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、刀豆蛋白A(concanavalin, ConA)購(gòu)自Sigma公司。腺病毒載體Ad-HSP70-HBsAg由本室自行構(gòu)建［2］。

1.3 小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)

參考Inaba［3］等方法并稍作改進(jìn)，拉頸處死C57BL／6J小鼠，無(wú)菌取小鼠的股骨、脛骨，用PBS液清洗股骨、脛骨3次。剪開(kāi)股骨、脛骨的兩端，用PBS液沖出骨髓細(xì)胞，收集骨髓細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液(Tris NH4Cl)處理后，于300g（離心力），離心10min。以含10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞的密度為2×106/ml，加入到6孔培養(yǎng)板中，每孔2ml，于37℃、5%CO2孵箱孵育2h，輕輕吸棄未粘附的懸浮細(xì)胞，用RPMI-1640液沖洗3次去掉未粘附細(xì)胞，再加入2ml含細(xì)胞因子rmGM-CSF(100ng/ml)和rmIL-4(50 ng/ml)的完全RPMI 1640液，于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隔天半量換液1次，補(bǔ)加細(xì)胞因子。于第7天，添加5ng/ml rmTNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)至第12d，收集懸浮細(xì)胞為成熟的DC細(xì)胞。

1.4 HBsAg--HSP70-DC瘤苗的制備［4］

按上述方法分離小鼠骨髓細(xì)胞，進(jìn)行DC誘導(dǎo)培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第5天時(shí)加入200μl腺病毒Ad-HSP70-HBsAg(1×107病毒／m1)，于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，病毒感染后第一天，將培養(yǎng)液體上清去除，加入含細(xì)胞因子新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后隔天半量換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)至第10天，收獲細(xì)胞。

1.5 荷瘤小鼠模型的建立

正常C57BL／6J小鼠隨機(jī)分成3組（每組10只），將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG222.1.5肝癌細(xì)胞接種于小鼠右后腿根部外側(cè)腿(5×105細(xì)胞／只，0.2mL/只)，建立荷瘤小鼠模型，每2～3天觀察一次腫瘤生長(zhǎng)情況。

1.6 HSP70-HBsAg-DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的治療

1.6.1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗回輸途徑比較及對(duì)荷瘤小鼠的治療效果

按1.5方法建立的荷瘤小鼠模型，7d后分別通過(guò)瘤體內(nèi)(intra-tumor)注射，皮下(hypo-derma1)注射或尾靜脈(intravein)注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)，7d后再加強(qiáng)免疫治療1次，每2d～3d觀察一次腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量相互垂直的最大徑，以面積表示腫瘤大小，記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.6.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫治療效果

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG222.1.5肝癌細(xì)胞接種于小鼠腿部皮下(5×105細(xì)胞／只)，隨機(jī)分3組，每組10只，7 d后采用最佳免疫治療途徑，分別注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)、未轉(zhuǎn)染DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)，7d后再加強(qiáng)免疫治療1次，每2～3d觀察一次腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量相互垂直的最大徑，以面積表示腫瘤大小，記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線，共觀察36d。

1.7 HSP70-HBsAg-DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的免疫保護(hù)性作用

正常C57BL／6J小鼠隨機(jī)分成3組（每組10只），經(jīng)HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)、未轉(zhuǎn)染DC瘤苗(1×106細(xì)胞／只，0.2mL/只)分別皮下注射免疫2次，間隔7d，于第2次免疫后7d，分別從皮下接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG222.1.5肝癌細(xì)胞，觀察瘤體生長(zhǎng)情況,共觀察36d。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，資料采用方差統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同途徑注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對(duì)荷瘤小鼠模型治療效果比較

我們首先比較了HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途徑回輸后的抗腫瘤效應(yīng)。分別通過(guò)皮下、尾靜脈、瘤體內(nèi)注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對(duì)荷瘤小鼠模型治療，36天內(nèi)腫瘤大小變化見(jiàn)表1?？梢钥闯?，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長(zhǎng)明顯緩慢，經(jīng)方差統(tǒng)計(jì)分析，皮下、尾靜脈、瘤體內(nèi)注射三組之間比較有明顯差異（F=18.2253，P＜0.01），兩兩之間比較：瘤苗皮下注射組與瘤體內(nèi)注射組比較，q＝8.5382，P＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；皮下注射組與尾靜脈注射組比較，q＝4.2827，P＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；瘤體內(nèi)注射組與尾靜脈注射組比較，q＝4.2555，P＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組明顯優(yōu)于瘤體內(nèi)注射組、尾靜脈注射，提示最佳免疫治療途徑為皮下注射途徑。因此，我們采用皮下注射途徑進(jìn)行下列各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。

表1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途徑回輸后腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)大小比較(mm2)

2.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫治療效果分析

從表2可見(jiàn)，采用皮下免疫治療，HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長(zhǎng)明顯緩慢，HBsAg-DC瘤苗組次之，未轉(zhuǎn)染DC組腫瘤的生長(zhǎng)速度最快，提示采用皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌有一定的免疫治療作用。經(jīng)方差分析，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉(zhuǎn)染DC組三組之間比較有明顯差異（F=25.8472，P＜0.01），兩兩之間比較：HSP70-HBsAg-DC組與HBsAg-DC組，q＝3.4595，P＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HSP70-HBsAg-DC組與未轉(zhuǎn)染DC組比較比較，q＝10.0102，P＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HBsAg-DC組與未轉(zhuǎn)染DC組比較，q＝6.5506，P＜0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，采用皮下免疫治療，HSP70-HBsAg-DC組優(yōu)于HBsAg-DC瘤苗組、未轉(zhuǎn)染DC組(P＜0.05)。

表2 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未轉(zhuǎn)染DC回輸后腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)大小比較(mm2)

2.3 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接種后對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)作用

免疫小鼠對(duì)HepG222.1.5肝癌細(xì)胞再次攻擊的抵抗作用如表3所示，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫小鼠能有效抵抗HepG222.1.5腫瘤細(xì)胞的再次攻擊，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接種后，腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，瘤體出現(xiàn)延遲，同時(shí)生長(zhǎng)減慢，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉(zhuǎn)染DC組三組間36天內(nèi)腫瘤大小變化分別為：(11.08±5.61)mm2、(33.12±11.67)mm2、(63.31±28.92)mm2，未轉(zhuǎn)染DC對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞攻擊的保護(hù)作用明顯減弱，而未轉(zhuǎn)染DC組對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞的攻擊保護(hù)作用很弱，所有小鼠均長(zhǎng)出腫瘤。經(jīng)方差分析，HSP70-HBsAg-DC組、HBsAg-DC組、未轉(zhuǎn)染DC組三組之間比較有明顯差異（F=20.5431，P＜0.01）。提示HBsAg-DC瘤苗免疫接種對(duì)肝癌細(xì)胞有一定的免疫保護(hù)作用。

表3 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未轉(zhuǎn)染DC對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)后腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)情況比較(mm2)

3 討論

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DC瘤苗注射途徑對(duì)誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答意義重大［5-6］。DC瘤苗的輸入途徑可能決定了細(xì)胞免疫能否發(fā)生及發(fā)生的強(qiáng)弱。有文獻(xiàn)報(bào)道用111In標(biāo)記的DC分別經(jīng)靜脈、皮下和皮內(nèi)途徑 注入患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)靜脈注入的DC主要分布于肝臟、脾和骨髓,而皮內(nèi)注入的DC快速移至局部淋巴結(jié)［7］。Fong等［8］將體外致敏的DC分別采用皮內(nèi)、淋巴管及靜脈三種不同的途徑輸入前列腺癌患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)三種途徑雖然均能誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答,但反應(yīng)程度各不相同。經(jīng)皮內(nèi)和淋巴管途徑能產(chǎn)生高水平的TNF-γ，更易誘導(dǎo)Th1 應(yīng)答，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，皮內(nèi)和皮下注射DC比靜脈注射更易誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。皮下免疫DC瘤苗傾向于產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，而靜脈注射DC瘤苗傾向于Th2型免疫應(yīng)答［9］。由于皮下注射使用方便，無(wú)輸液反應(yīng)且易誘導(dǎo)Th1應(yīng)答，是使用DC瘤苗的較好途徑。

宋文剛等［10］采用皮下注射、靜脈注射和瘤體注射三種途徑回輸AFP－DC瘤苗，比較觀察AFP－DC瘤苗對(duì)荷瘤小鼠免疫治療作用，發(fā)現(xiàn)皮下注射AFP－DC瘤苗治療效果在抑制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)小鼠存活期方面都明顯優(yōu)于瘤體內(nèi)注射或尾靜脈注射。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，采用皮下注射途徑注射HBsAg修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）瘤苗，對(duì)肝癌荷瘤小鼠能夠產(chǎn)生特異性的CTL效應(yīng)，延緩腫瘤的生長(zhǎng)，但這種免疫治療還不夠理想，如何進(jìn)一步這種提高特異性CTL的效應(yīng)？研究發(fā)現(xiàn)DC、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞表面存在熱休克蛋白（HSP）受體，熱休克蛋白70（HSP70）融合蛋白能夠刺激DC上MHCI、MHCII及B7分子水平，還可激活NK細(xì)胞，從而進(jìn)一步達(dá)到增強(qiáng)免疫效果的作用。目前，HSP70被認(rèn)為可能是一種理想的疫苗增效劑。為此，我們前期構(gòu)建了攜帶HSP70-HBsAg嵌合基因的重組腺病毒載體，建立了攜帶HSP70-HBsAg嵌合基因的DC瘤苗，初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗組腫瘤的生長(zhǎng)較靜脈注射組、瘤體內(nèi)注射組明顯減慢。造成以上結(jié)果的可能原因：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下免疫DC瘤苗，能夠按照預(yù)期的目的進(jìn)人引流淋巴結(jié)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈注射DC瘤苗后，DC首先聚集在肺臟、然后是肝臟、脾臟，它們不能有效的進(jìn)入淋巴結(jié)，導(dǎo)致相應(yīng)T細(xì)胞克隆的失能；瘤體注射DC瘤苗后，因腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生免疫抑制因子影響DC發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于單純HBsAg瘤苗組和空白對(duì)照組，這可能與HSP70作為免疫優(yōu)勢(shì)抗原誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫，具有明顯的免疫佐劑效應(yīng)相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，HSP70能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段誘導(dǎo)抗肝癌腫瘤免疫，可能是一種具有潛在應(yīng)用前景的生物治療方法。

［1］Hsu KF, Hung CF,Cheng WF, et al. Enhancement of suicidal DNA vaccine potency by linking Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 to an antigen［J］. Gene Ther, 2001,8(5):376-383.

［2］雷春亮，黃呈輝，楊湛，等.攜帶HSP70-HBsAg嵌合基因復(fù)制缺陷型重組腺病毒的制備［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2008,22(1):136-138.

［3］Inaba K,Inaba M,Romani N,et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with grannulocyte/macrophage colony stimulating factor［J］.J Exp Med,1992,176:1693-1702.

［4］雷春亮,歐陽(yáng)玲,楊湛,等.腺病毒介導(dǎo)HSP70-HBsAg嵌合基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞及生物學(xué)特性分析［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2009,23(1):29-31.

［5］Lambert LA,Gibson GR,Maloney M,et al.Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed dendritic cells enhances protective antitumor immunity［J］.Cancer Res,2001,61(2):641-646.

［6］王寶中，王麗萍，王彥文，等.單用A23187誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞成樹(shù)突狀細(xì)胞及其介導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞殺傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué),2010,16(10):12-13.

［7］Morse MA,Coleman RE,Akabani G,et al.Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies［J］.Cancer Res,1999,59:56-58.

［8］Fong L,Broch stedt D,Benike C,et al.Dendritic cells injected viadifferent routes induce immunity in cancer patients［J］.J Immunol,2001,166:4254-4259.

［9］Timmerman JM，Levy R.Linkage of foreign carrier protein to a self-tumor antigen enhances the immunogenicity of a pulsed dendritic cell vaccine［J］.J lmmunol,2000,164:4797-4803.

［10］宋文剛,曲迅,李雅林，等.不同途徑免疫的AFP基因修飾DC瘤苗體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的研究［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2004,11(1):22-26.

［11］Broquet AH,Thomas G,Masliah J,et al.Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release［J］.J Bio Chem,2003,278(24):21601-21606.