蔣 偉，黎滿香，田世成，顏運(yùn)秋

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

在長期的進(jìn)化過程中，細(xì)菌往往通過各種各樣的策略來使自己適應(yīng)各種環(huán)境，從而使細(xì)菌能在各種復(fù)雜的環(huán)境中生存。而在基因水平，細(xì)菌能獲得新的外源基因促使它抵抗環(huán)境選擇壓力，這是細(xì)菌進(jìn)化過程中的一個重要因素。很多細(xì)菌和古細(xì)菌都是從其他細(xì)菌中利用核酸交換來獲得外源基因，這種交換被稱為基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer；HGT），例如糞腸球菌中約三分之一的基因組由可移動性片段組成。HGT即是從環(huán)境中攝取可移動性片段的DNA（例如質(zhì)粒，噬菌體等），然后整合到自己的基因組中從而獲得相應(yīng)的表型的過程。然而在這些水平轉(zhuǎn)移中，只有極少一部分能給細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢。為避免冗于的水平轉(zhuǎn)移（即不能給宿主細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢的水平轉(zhuǎn)移），細(xì)菌在進(jìn)化過程中形成了上百種的自我保護(hù)機(jī)制，例如目前了解最為透切的消除入侵生物的限制性修飾酶系統(tǒng)和表面排斥現(xiàn)象等［1］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR位點(diǎn) （CRISPR loci）廣泛存于細(xì)菌及古細(xì)菌基因組中。其主要結(jié)構(gòu)以高度保守的重復(fù)序列、完全不同的間區(qū)相互交替排列而成，在這種重復(fù)序列遠(yuǎn)端還存在與這種重復(fù)序相關(guān)的蛋白，二者相互輔助以完成其特定的生物學(xué)功能。

1 CRISPR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

Ishino Y等［2］在對大腸埃希菌中的堿性磷酸酶的同工酶Ipa對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)在該產(chǎn)物編碼區(qū)的下游存在一個由29個堿基組成的、重復(fù)出現(xiàn)的高度保守的核酸序列，兩個重復(fù)序列之間由長度大致相等的獨(dú)特的非重復(fù)核酸序列間隔開。隨后，Mojica F J等［3］在對地中海極嗜鹽菌（Haloferaxmediterranei）和沃爾卡尼極嗜鹽菌（Haloferax volcanii）的研究中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。在其他一些細(xì)菌的研究中，這種類似的基因結(jié)構(gòu)被廣泛報(bào)道。隨著類似的結(jié)構(gòu)被廣泛的發(fā)現(xiàn)，直到1991年Hermans P W等才把這種結(jié)構(gòu)正式命名SRSR（short regularly spaced repeats），2002年被Jansen R改名為CRISPR并一直沿用至今［3－7］。隨著細(xì)菌的全基因組測定的完成，已經(jīng)在90%的古細(xì)菌及40%的細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)，更令人驚奇的是在大部分已發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的細(xì)菌中含有至少1個CRISPR位點(diǎn)，有的甚至含有2個或3個該位點(diǎn)［8］。

2 CRISPR－Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

2.1 CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)

CRISPR位點(diǎn)由一個前導(dǎo)區(qū)（leader）、多個重復(fù)序列（repeat）和多個間區(qū)（spacer）組成，這些重復(fù)序列與間區(qū)相互交替出現(xiàn)并串連成一個完整的CRISPR位點(diǎn)（如圖1A）。前導(dǎo)區(qū)一般是處于CRISPR位點(diǎn)上游，由300bp～500bp堿基組成的一個AT富集的區(qū)域。這個區(qū)域一般來說在種內(nèi)是比較保守的，但在種間卻有顯著的差異［7］。重復(fù)序列一般由23bp～50 bp的堿基組成，其平均長度在31bp左右。這段序列在已給定的CRISPR位點(diǎn)的多個重復(fù)中相對保守，一般只存在1個～3個堿基差異，這種差異被稱為退化重復(fù)（degeneration repeats，DRs），但在微生種間甚至于同一個基因組中的兩個或多個不同的CRISPR位點(diǎn)間卻存在很大的差異。通過對CRISPR DataBase［8］中貯存的所有重復(fù)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列間沒有明顯的聯(lián)系，但卻具有二重對稱性，這就意味著它能形成像發(fā)夾一樣的二極結(jié)構(gòu)。到目前為止，還沒有關(guān)于這些重復(fù)序列具體功能的描述。間區(qū)由17bp～84bp堿基組成，平均長度在36bp左右。在同一個CRISPR位點(diǎn)中，基本上沒有相同或比較相似的間區(qū)。通過長期的研究發(fā)現(xiàn)，部分間區(qū)序列與已知的或質(zhì)粒、或噬菌體的序列相匹配［3］。在CRISPR DataBase中的間區(qū)序列，只有約2%的序列在Gen－Bank中能找到相應(yīng)的匹配，這可能是因?yàn)槟壳爸挥袠O少的噬菌體和質(zhì)粒被測序分析，隨著測序分析技術(shù)的逐漸成熟，這個比例在不斷的增加［9］。

圖1 CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖（A代表CRISPR位點(diǎn)；B代表整個CRISPR系統(tǒng)）Fig.1 The structure of CRISPR－loci（A represents CRISPR loci；B represents the whole element of CRISPR system）

2.2 CRISPR－Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

在生物機(jī)體內(nèi)，最終起到調(diào)節(jié)生命作用的物質(zhì)是肽或者蛋白質(zhì)，而如圖1A所示的整個區(qū)域都是非編碼區(qū)，對于實(shí)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)的功能顯然不現(xiàn)實(shí)。因此，在微生長期的進(jìn)化過程中，為了使CRISPR宿主能適應(yīng)各種環(huán)境，必定有相關(guān)蛋白質(zhì)起著調(diào)節(jié)作用。Jansen R等［7］對CRISPR側(cè)翼序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)4段基因，并依次命名為cas1、cas2、cas3、cas4，這4段基因通常都與CRISPR位點(diǎn)同時出現(xiàn)于幾乎所有CRISPR位點(diǎn)陽性細(xì)菌的基因組中，且這4段基因在不同的細(xì)菌基因組間具有顯著的同源性，說明這4段基因可能與CRISPR位點(diǎn)存在某種關(guān)系。這些Cas蛋白或鄰接于CRISPR位點(diǎn)下游（圖1B），或分散于其他地方，目前發(fā)現(xiàn)距CRISPR位點(diǎn)最遠(yuǎn)的達(dá)到了9 kb。通過進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)存在高度保守的氨基酸殘基或／和功能結(jié)構(gòu)域（amino acid resi－dues or／and functional domains）。這4個蛋白通常以cas4－cas3－cas1－cas2的順序存在于染色體或質(zhì)粒上，其中Cas3類似于一種解旋酶，而Cas4類似于RecB家簇的一種半胱氨酸富集的核酸內(nèi)切酶上。這些酶的功能以及其排列順序或許預(yù)示著這些蛋白質(zhì)存在一種特定的作用機(jī)制。通過大量的序列比對分析發(fā)現(xiàn)，Cas1似乎是CRISPR位點(diǎn)中最基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)，因?yàn)樵谒泻蠧RISPR位點(diǎn)的生物種中都發(fā)現(xiàn)了cas1。到目前為止，已有40多種伴隨CRISPR位點(diǎn)的Cas蛋白被鑒定［10］。這些蛋白存在多樣性，有趣的是每一個CRISPR都含有一個特異性的CRISPR位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的被縮寫為csx（“x”代表亞型的第一個字母，例如，csy代表Yersina亞型）的基因，因此Haft D H等跟據(jù)該位點(diǎn)對45種Cas蛋白的攜帶情況，將CRISPR位點(diǎn)分成9種亞型（表1）［15］。由表1可以看出cas1－cas6這六種蛋白廣泛存在于CRISPR亞型中，可以說是CRISPR位點(diǎn)的核心蛋白，而其中又?jǐn)?shù)cas1最為常見，存在于所有亞型中［11］。但對于普遍存在于所有亞型中的Cas1蛋白的功能卻存在較大的爭論。Wiedenheft B等從綠膿桿菌中得到的Cas1蛋白有金屬依賴性，dsDNA特異性核酸內(nèi)切酶功能，而Han D H等從Sulpholobus solfataricus中得到的Cas1蛋白卻表現(xiàn)為序列非特異性、多位點(diǎn)、高親合力的核酸結(jié)合蛋白的功能［12－14］。

3 CRISPR位點(diǎn)的功能

在自然界中，微生物可以說無處不在。當(dāng)細(xì)菌存在于較為惡劣的環(huán)境中時，它該如何抵御外界的干擾呢？從地球上開始有生物至今，在長期的自然選擇壓力作用下，這些微生物得以進(jìn)化，使其能在自然選擇的壓力下存活。在這個漫長的進(jìn)化過程中，它們形成了許多用于保護(hù)自己的，幾乎接近完美的功能性系統(tǒng)。這些功能性系統(tǒng)能使其從其他微生物或環(huán)境中獲得對自己有利的基因，例如基因盒－整合子系統(tǒng)（integron－cassette system）能使細(xì)菌從其他供體菌中獲得用來抵抗環(huán)境中對應(yīng)藥物的耐藥基因；但同時也存在另外一些系統(tǒng)限制這種過程的發(fā)生，一般來說是限制對自己有害的基因進(jìn)入自身，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的，例如許多革蘭陽性及革蘭陰性菌中的表面排拆（surface exclusion）功能，它能從分子水平降低受體菌的接受能力，從而降低自身對有害的基因片段的接受能力［16］。

表1 Cas蛋白亞型的分類Table 1 Classification of Cas protein subtypes

在這些自我保護(hù)系統(tǒng)中，CRISPR系統(tǒng)亦是其中之一。最早人們對CRISPR系統(tǒng)的認(rèn)識是通過對噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體是細(xì)菌最為常見的入侵者（invader），為了抵御噬菌體的入侵，即在長期的進(jìn)化過程中細(xì)菌形成了用于抵抗噬菌體入侵的CRISPR系統(tǒng)，從分子水平來說，這個過程可分為三個階段。（1）合并整合形成新間區(qū)；（2）表達(dá)加工 CRISPR RNAs（crRNAs）；（3）crRNAs干擾入侵的噬菌體［17］。整個過程類似于機(jī)體的免疫反應(yīng)過程，故而此過程被稱為遺傳記憶（genetic memory）。

3.1 新間區(qū)的獲得

當(dāng)細(xì)菌與噬菌體共處于同一環(huán)境中時，噬菌體為了自身生存，必定定植于細(xì)菌表面，然后借助于細(xì)菌DNA復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行繁殖。當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入攜帶有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)胞膜內(nèi)時，該宿主體內(nèi)的CRISPR相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合體中類似于Cas1核酸結(jié)合蛋白將會迅速的介導(dǎo)該復(fù)合體與噬菌體DNA進(jìn)行結(jié)合，然后通過類似于Cas2核酸內(nèi)切酶功能等蛋白質(zhì)的作用，將該DNA切割成17bp～84bp不等的核酸小片段，然后在相關(guān)蛋白的作用下，將其中的一個小片段整合至前導(dǎo)區(qū)與第一個重復(fù)之間形成一個新的間區(qū)（圖2A）。通過這樣一個過程，CRISPR位點(diǎn)就整合進(jìn)了一個新的間區(qū)。這就使宿主快速的適應(yīng)環(huán)境中的入侵者，因此我們也可以將這個階段稱為適應(yīng)（Adaptation）階 段。Bolotin A 等［18］研 究 發(fā) 現(xiàn)，CRISPR位點(diǎn)中間區(qū)的個數(shù)與宿主對噬菌體的敏感性呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)而Barrangou R等利用噬菌體去攻擊至少含有一個CRISPR位點(diǎn)的嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus），最終在前導(dǎo)序列及第一個重復(fù)間區(qū)找到一個新的間區(qū)，而且變異株對該噬菌體的敏感性降低，證明了該位點(diǎn)具有抵御外源DNA片段的入侵的功能［19－20］。在序列分析中，有些序列來源于細(xì)菌質(zhì)粒，證明CRISPR位點(diǎn)也能從質(zhì)粒上獲得新的間區(qū)。

3.2 表達(dá)加工處理CRISPR

當(dāng)新的間區(qū)穩(wěn)定地存在于CRISPR位點(diǎn)后，間區(qū)所包含的信息將通過CRISPR途徑來保護(hù)宿主不受特定的核酸攻擊。然而要實(shí)現(xiàn)這樣一個途徑，最基本的就是要將間區(qū)加工處理以形成較小的crRNAs。CRISPR的轉(zhuǎn)錄首先在閃爍古球菌（Archaeoglobusfulgidus）中被發(fā)現(xiàn)［21］。此研究表明位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)錄首先從前導(dǎo)序列的末端開始，也就是說在前導(dǎo)序列的末端可能含有CRISPR啟動子（CRISPR promoter），從啟動子開始轉(zhuǎn)錄，重復(fù)序列和間區(qū)先被轉(zhuǎn)錄成前體物RNA（precursor RNA；pre－crRNA）。此時核心蛋白Cas1－Cas4將會共同形成一個復(fù)合物，這個復(fù)合物將pre－crRNA從特異性位點(diǎn)上（此特異性位點(diǎn)具體何在尚不清楚，有報(bào)道表明在間區(qū)的約第8個堿基處，但也有報(bào)道稱在重復(fù)序列上）剪切成更小的crRNA，隨后較小的crRNA與蛋白質(zhì)形成具有特殊功能的復(fù)合物crRNP（crRNA－Cas ribonucleoprotein）［22］（圖2B）。

3.3 crRNAs干擾入侵核酸

當(dāng)宿主再次接觸到環(huán)境中的噬菌體或是質(zhì)粒時，crRNP將會迅速地通過核酸結(jié)合蛋白與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源核酸特異性結(jié)合，這種特異性是由新整合進(jìn)入間區(qū)所存貯的信息決所決定。然后在核酸內(nèi)切酶的作用下，將目標(biāo)核酸從3′端開始剪切成適合長度（大約為18bp）的小片段，致使目標(biāo)核酸無法形使它的功能，噬菌體復(fù)制失敗，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移失敗，從而達(dá)到保護(hù)宿主的目的（圖2C）。

通過以上三個階段，CRISPR位點(diǎn)行使了它具有的功能。然而它仍然面臨所有生理反應(yīng)所面臨的問題，即如何識別自身與非自身核酸，從而避免發(fā)生“自身免疫”。在CRISPR位點(diǎn)中，新間區(qū)所攜帶的與crRNA仍然存在著對應(yīng)的關(guān)系。最近一項(xiàng)研究表明，crRNP在體外試驗(yàn)中，能夠區(qū)別目標(biāo)核酸與非目標(biāo)核酸［23］，可能是因crRNP中的crRNA與目標(biāo)核酸存在對應(yīng)的配對關(guān)系，從而能準(zhǔn)確的識別目標(biāo)核酸。

4 展望

到目前為止，CRISPR位點(diǎn)在很多細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)。這樣普遍的存在于細(xì)菌及古細(xì)菌中，證明該位點(diǎn)對于細(xì)菌的生存進(jìn)化有著舉足輕重的作用。通過進(jìn)一步深入的研究，探明該位點(diǎn)的作用機(jī)制，將使我們對微生物的認(rèn)識更加深入。一方面，通過該位點(diǎn)的間區(qū)序列差異，理論上可以推論該細(xì)菌在進(jìn)化過程的某些細(xì)節(jié)。另一方面，通過目前對于該位點(diǎn)的研究，如果能將該位點(diǎn)通過分子生物學(xué)方法，整合進(jìn)入工程質(zhì)粒，然后應(yīng)用于工業(yè)細(xì)菌中，例如食物產(chǎn)品及大規(guī)模發(fā)酵等領(lǐng)域，將會給食品安全帶來一個革命性的轉(zhuǎn)折。另外，利用該位點(diǎn)的干擾功能，我們亦可在其中引入某種內(nèi)源性基因的間區(qū)，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主，或許可以達(dá)到基因沉默的目的，但這一點(diǎn)尚沒有試驗(yàn)證明。此外，CRISPR位點(diǎn)既然能抵御外源基因的入侵，那么由可移動元件介導(dǎo)的耐藥基因在細(xì)菌的的傳播過程是否也能被這種機(jī)制所抑制呢？關(guān)于這一點(diǎn)尚待試驗(yàn)證明［24］。如果該位點(diǎn)對于某些耐藥性質(zhì)粒或是耐藥基因，也能達(dá)到沉默的目的，那么，通過對該位點(diǎn)的克隆、轉(zhuǎn)化，將會使全球性的耐藥問題得以緩解。

總之，介于該位點(diǎn)中已知的作用機(jī)制和有待試驗(yàn)證明的未知的作用機(jī)制，該位點(diǎn)對于我們對微生界的認(rèn)識都有十分顯著的作用。因此，對于CRISPR位點(diǎn)的研究，具有無可比擬的重要性。

［1］Asakura Y，Kojima H，Kobayashi I.Evolutionary genome engineering using a restriction－modification system ［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（20）：9034－9046.

［2］Ishino Y，Shinagawa H，Makino K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli，and identification of the gene product［J］.J Bacteriol，1987，169（12）：5429－5433.

［3］Mojica F J，F(xiàn)errer C，Juez G，et al，Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the ArchaeaHaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiand could be involved in replicon partitioning［J］.Mol Microbiol，1995，17（1）：85－93.

［4］Hermans P W，van Soolingen D，Bik E M，et al.Insertion element IS987from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot－spot integration region for insertion elements inMycobacteriumtuberculosiscomplex strains［J］.Infect Immun，1991，59（8）：2695－2705.

［5］Klenk H P，Clayton R A，Tomb J F，et al.The complete genome sequence of the hyperthermophilic，sulphate－reducing archaeonArchaeoglobusfulgidus［J］.Nature，1997，390（6658）：364－370.

［6］Kawarabayasi Y，Hino Y，Horikawa H，et al.Complete genome sequence of an aerobic hyper－thermophilic crenarchaeon，AeropyrumpernixK1［J］.DNA Res，1999，6（2）：83－101，145－152.

［7］Jansen R，Embden J D，Gaastra W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes［J］.Mol Microbiol，2002，43（6）：1565－1575.

［8］Grissa I，Vergnaud G，Pourcel C.The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats［J］.BMC Bioinformatics，2007，8（172）：1－10.

［9］Heidelberg J F，Nelson W C，Schoenfeld T，et al.Germ warfare in a microbial mat community：CRISPRs provide insights into the coevolution of host and viral genomes［J］.PLoS one，2009，4（1）：e4169.

［10］Hale C R，Zhao P，Olson S，et al.RNA－guided RNA cleavage by a CRISPR RNA－Cas protein complex［J］.Cell，2009，139（5）：945－956.

［11］Haft D H.，Selengut J，Mongodin E F，et al.A guild of 45 CRISPR－associated（Cas）protein families and multiple CRISPR／Cas subtypes exist in prokaryotic genomes［J］.PLoS Comput PLoS Comput Biol，2005，1（6）：e60.

［12］Wiedenheft B，Zhou K，Jinek M，et al.Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR－medi－ated genome defense［J］.Structure，2009，1（6）：904－912.

［13］Han D，Lehmann K，Krauss G.SSO1450—a CAS1protein fromSulfolobussolfataricusP2with high affinity for RNA and DNA ［J］.FEBS Lett，2009，583（12）：1928－1932.

［14］Jore M M，Lundgren M，van Duijn E，et al.Structural basis for CRISPR RNA－guided DNA recognition by Cascade ［J］.Nat Struct Mol Biol，2011，18（5）：529－536.

［15］Marraffini L A，Sontheimer E J.CRISPR interference：RNA－directed adaptive immunity in bacteria and archaea ［J］.Nat Rev Genet，2010，11（3）：181－190.

［16］Possoz C，Gagnat J，Sezonov G，et al.Conjugal immunity ofStreptomycesstrains carrying the integrative element pSAM2is due to the pif gene（pSAM2immunity factor）［J］.Mol Microbiol，2003，47（4），1385－1393.

［17］van der Oost J，Jore M M.，Westra E R，et al.CRISPR－based adaptive and heritable immunity in prokaryotes［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（8）：401－407.

［18］Bolotin A，Quinquis B，Sorokin A，et al.Clustered regularly interspaced short palindrome repeats（CRISPRs）have spacers of extrachromosomal origin［J］.Microbiology，2005，151（Pt8）：2551－2561.

［19］Barrangou R，F(xiàn)remaux C，Deveau H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes［J］.Science，2007，315（5819）：1709－1712.

［20］Tang T H，Bachellerie J P，Rozhdestvensky T，et al.Identification of 86candidates for small non－messenger RNAs from the archaeonArchaeoglobusfulgidus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（11）：7536－7541.

［21］Kunin V，Sorek R，Hugenholtz P.Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats［J］.Genome Biol，2007，8（4）：R61.

［22］Marraffini L A，Sontheimer E J.Self versus non－self discrimination during CRISPR RNA－directed immunity［J］.Nature，2010，463（7280）：568－571.

［23］Horvath P，Barrangou R.CRISPR／Cas，the immune system of bacteria and archaea［J］.Science，2010，327（5962）：167－170.

［24］Palmer K L，Gilmore M S.Multidrug－resistant enterococci lack CRISPR－cas［J］.MBio，2010，1（4）：pii：e00227－10.