劉萌萌，高存帥，徐 玉，畢可東

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109）

黏桿菌素（colistin）又名多黏菌素E（polymyxin E），是多黏芽胞菌（Paenibacilluspolymyxa）產(chǎn)生的一組堿性環(huán)狀多肽類抗生素［1］。硫酸黏桿菌素對大部分革蘭陰性細(xì)菌具有強(qiáng)大的殺菌作用，如綠膿桿菌、大腸埃希菌、沙門菌和變形桿菌等，對綠膿桿菌的作用尤為顯著，處于生長期和靜止期的細(xì)菌均能很快被殺死。同時，還能通過破壞內(nèi)毒素的超微結(jié)構(gòu)中和革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，頡頏內(nèi)毒素的致熱性［2－3］。甘氨酸是一種中性氨基酸，可通過破壞內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)，有效降低血漿中腸源性內(nèi)毒素的水平［4］，同時還可下調(diào)肝組織脂多糖結(jié)合蛋白mRNA和內(nèi)毒素受體基因CD14蛋白的表達(dá)［5－6］，從而有效減輕肝損傷。

甘氨酸和黏桿菌素聯(lián)合應(yīng)用可有效地頡頏內(nèi)毒素引起的發(fā)熱，減輕黏桿菌素的毒副反應(yīng)［7］。但甘氨酸對黏桿菌素抑菌作用的影響未見報道。本試驗(yàn)通過觀察甘氨酸和硫酸黏桿菌素聯(lián)用對大腸埃希菌、綠膿桿菌和沙門菌體外抑菌作用的影響，以期了解甘氨酸對硫酸黏桿菌素是否具有增效作用，從而為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 硫酸黏桿菌素，批號110116，含量23 000IU／mg，廣州市某有限公司生產(chǎn)；甘氨酸，批號110414，含量99.9%，天津市某有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 菌株來源 試驗(yàn)用菌株：臨床分離的豬源性致病性大腸埃希菌、綠膿桿菌和沙門菌各10株，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，綠膿桿菌ATCC97853，由濟(jì)南90醫(yī)院提供；豬沙門菌（C78－51），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 培養(yǎng)基 M－H 肉湯，營養(yǎng)瓊脂，麥康凱瓊脂，SS瓊脂，十六烷三甲基溴化銨瓊脂。

1.1.4 儀器及設(shè)備 DRP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；BCM－100型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ZDX－351型座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SPS6000F電子天平，梅特勒－拖利多稱量設(shè)備公司產(chǎn)品；單道可調(diào)移液器、8道可調(diào)移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 將全部菌株經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)（大腸埃希菌于麥康凱培養(yǎng)基、沙門菌于SS培養(yǎng)基、綠膿桿菌于十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基），重新劃線分離后，挑取單菌落2個～3個，接種到3mL～5mL M－H肉湯中，于37℃培養(yǎng)8h～10h。以平板計數(shù)法［8］進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

1.2.2 藥液制備 甘氨酸和硫酸黏桿菌素分別用無菌蒸餾水及pH6.0的磷酸鹽緩沖液溶解后，制成32 768μg／mL和1 638.4μg／mL的儲備液，無菌條件下過濾除菌，備用。

1.2.3 單藥最低抑菌濃度（MIC）測定方法 采用微量肉湯稀釋法［9］，分別測定甘氨酸和硫酸黏桿菌素對33株細(xì)菌的單藥MIC值，接種菌量為1×105cfu／mL，37℃孵育18h～24h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)時，每個濃度各做3個重復(fù)，同時以標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC25922、ATCC97853做質(zhì)量控制。

1.2.4 聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 采用微量肉湯棋盤稀釋法［9］，測定甘氨酸和硫酸黏桿菌素對33株細(xì)菌的聯(lián)合 MIC值，以兩藥對應(yīng)各菌的 MIC值的4、2、1、1／2、1／4、1／8、1／16倍濃度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上分別按縱列和橫列進(jìn)行聯(lián)合，接種菌量為1×105cfu／mL，37℃孵育18h～24h，觀察結(jié)果。

1.2.5 結(jié)果判定 以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)做為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判定依據(jù)：FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為頡頏作用。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對大腸埃希菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 綠膿桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對綠膿桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3 沙門菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對沙門菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表1 甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對大腸埃希菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against E.coli in vitro

表2 甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對綠膿桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against P.aeruginosa in vitro

表3 甘氨酸和硫酸黏桿菌素單用及聯(lián)合對沙門菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against Salmonella in vitro

3 討論

體外抑菌試驗(yàn)的常用方法主要有常量肉湯稀釋法、微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法3種。常量肉湯稀釋法準(zhǔn)確、可靠，但操作繁瑣；瓊脂稀釋法易發(fā)現(xiàn)污染菌，但制備含藥瓊脂平板費(fèi)時費(fèi)力，且測得的MIC值偏低。所以，本試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對3種細(xì)菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，操作簡單、重復(fù)性好，可以精確測定甘氨酸和硫酸黏桿菌素在不同的濃度比例下的相互作用。

此外，由本研究知，單用硫酸黏桿菌素對大腸埃希菌、綠膿桿菌和沙門菌較敏感，MIC值在0.64 μg／mL～5.12μg／mL之間。單用甘氨酸對各菌的MIC值較高，在2 048μg／mL～8 192μg／mL之間，細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。兩種藥物聯(lián)用后，其各自的聯(lián)合MIC值比單藥MIC有所降低，均達(dá)到了試驗(yàn)菌的半數(shù)以上，硫酸黏桿菌素的抗菌活性提高了2倍～4倍，甘氨酸活性提高16倍～512倍，表明甘氨酸對硫酸黏桿菌素具有增效作用。

同時，由表1、表3看出，兩種藥物聯(lián)用后主要表現(xiàn)相加作用，沙門菌中相加作用的占63.6%，大腸埃希菌中相加作用的占63.6%，兩者最佳用藥比例為100∶1。表2中，相加和協(xié)同作用各占54.5%和45.5%，說明對于綠膿桿菌兩者主要表現(xiàn)協(xié)同和相加作用，最佳比例為50∶1。出現(xiàn)此種結(jié)果，可能是由于不同細(xì)菌對二者聯(lián)合應(yīng)用的敏感度不同，才導(dǎo)致FIC指數(shù)范圍存在差異及二者最佳配伍比例的不同。二者聯(lián)用或協(xié)同或相加，這點(diǎn)在進(jìn)行藥物配方篩選時，應(yīng)充分加以考慮。

甘氨酸對硫酸黏桿菌素的增效機(jī)理目前尚不清楚。細(xì)菌的胞漿膜富含磷脂，對胞內(nèi)的低分子物質(zhì)（氨基酸、核苷酸、無機(jī)鹽、嘧啶、嘌呤等）具有選擇性屏障作用。這些物質(zhì)在胞內(nèi)具有較高的濃度，平均比胞外高出400倍～500倍，因此可保持胞內(nèi)高滲透壓［10］。黏桿菌素中游離的氨基能與細(xì)菌胞漿膜的磷脂物質(zhì)磷脂酰甘油相結(jié)合，使細(xì)胞膜的表面張力降低，通透性增高，使細(xì)胞內(nèi)的主要成分從胞漿中流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌生長發(fā)生抑制或引起細(xì)菌死亡［11］。此外，硫酸黏桿菌素為表面活性劑，含有親脂和疏脂基團(tuán)，可吸附在細(xì)胞壁上，其結(jié)構(gòu)中的親脂鏈烴可插入到細(xì)菌胞漿膜中，破壞菌體內(nèi)的電子鏈傳遞及氧化磷酸化過程，從而使細(xì)菌死亡［12］。硫酸黏桿菌素單用殺菌效果較低，可能是由于細(xì)菌死亡裂解后會產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，導(dǎo)致部分硫酸黏桿菌素與內(nèi)毒素結(jié)合而失去與細(xì)菌結(jié)合、殺菌的作用。

甘氨酸的分子結(jié)構(gòu)中也含有游離的氨基，可與游離磷酸基團(tuán)結(jié)合?？赡苡捎诩?xì)菌外有細(xì)胞壁阻隔，且甘氨酸不具吸附功能，所以低濃度時不易與細(xì)菌胞漿膜接觸并結(jié)合從而發(fā)揮殺菌作用。高濃度時，甘氨酸與細(xì)菌緊密接觸的幾率變大，所以可以有效與胞漿膜結(jié)合并殺菌。當(dāng)兩者聯(lián)用作用于菌液中時，硫酸黏桿菌素會迅速吸附到細(xì)菌細(xì)胞壁上，并通過其親脂鏈烴插入細(xì)菌細(xì)胞膜中，使其裂解死亡。死亡后釋放出的內(nèi)毒素可以迅速被周圍游離的甘氨酸結(jié)合，破壞內(nèi)毒素，從而降低了硫酸黏桿菌素與內(nèi)毒素結(jié)合的幾率，以便更好的發(fā)揮其殺菌作用。

綜上所述，甘氨酸對硫酸黏桿菌素具有增效作用。兩者聯(lián)合用藥不僅可以降低臨床使用劑量，有助于減少硫酸黏桿菌素的神經(jīng)毒性和腎毒性，還可以提高兩種藥物的療效，在實(shí)際應(yīng)用上有一定價值。但本試驗(yàn)只是體外藥敏試驗(yàn)，還需對二者的體內(nèi)藥代動力學(xué)及藥效學(xué)做進(jìn)一步探討，為今后在臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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