韓 偉，張 莉＊，鄢明華，李秀麗，高俊成，韓孝黨

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112；2.天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病。該病毒屬于皰疹病毒科甲皰疹病毒亞科［1－2］，豬是其自然宿主和儲(chǔ)存宿主，可以引起包括豬在內(nèi)的多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)病。新生仔豬臨床表現(xiàn)為呼吸困難、厭食、腹瀉和神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%；妊娠母豬可引發(fā)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙癥，耐過(guò)豬感染后形成潛伏感染而終身帶毒［3－4］。隨著PRV基因缺失疫苗的應(yīng)用，該病已經(jīng)得到有效控制，但在一些小規(guī)模豬場(chǎng)仍時(shí)有發(fā)生。筆者從天津某豬場(chǎng)分離到一株偽狂犬病病毒（TJ－1株），對(duì)其主要生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及細(xì)胞系 PRV TJ－1株、PK－15、BHK－21和Marc－145細(xì)胞均為天津市畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室保存。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，新生牛血清購(gòu)自北京民海生物有限公司，PRV熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 種蛋及試驗(yàn)用動(dòng)物 種蛋購(gòu)自天津市某種雞場(chǎng)，在本室孵化至10日齡后使用；試驗(yàn)用兔購(gòu)自天津西青區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒理化特性測(cè)定

1.2.1.1 病毒增殖及預(yù)處理 PK－15細(xì)胞接種 PRV TJ－1株，待出現(xiàn)90%～95%CPE時(shí)收獲毒液，3 000r／min離心20min，取上清用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1.2 乙醚敏感性試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。取滅菌離心管6只，各加入0.8mL收獲的TJ－1株病毒液，其中3管加入0.2mL乙醚，另3管加入0.2mL生理鹽水作為對(duì)照。密閉管口，充分震蕩，置4℃處理24h后2 000r／min離心20min。吸取含乙醚的離心管的下層病毒液，在超凈臺(tái)內(nèi)反復(fù)吹吸使乙醚完全揮發(fā)后備用。將6個(gè)離心管的病毒液分別接種PK－15細(xì)胞，測(cè)定其TCID50，病毒滴度降低2個(gè)數(shù)量級(jí)判為敏感，反之判為不敏感。

1.2.1.3 氯仿敏感性試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。取滅菌離心管6只，各加入1mL收獲的TJ－1株病毒液，其中3管加入48μL氯仿，另3管加入48μL生理鹽水作為對(duì)照。充分混勻震蕩，置4℃處理10min，500r／min離心5min。吸取試驗(yàn)組離心管上層的病毒液備用。將6個(gè)離心管的病毒液分別接種PK－15細(xì)胞，測(cè)定其TCID50，病毒滴度降低2個(gè)數(shù)量級(jí)判為敏感。

1.2.1.4 胰蛋白酶敏感性試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。取滅菌離心管6只，各加入0.5mL收獲的TJ－1株病毒液，其中3管加入0.5mL胰酶（濃度1%），另3管加入0.5mL生理鹽水作為對(duì)照。密閉管口，充分震蕩離心管，37℃水浴作用1h，加入滅活犢牛血清4mL，充分混合后備用。將6個(gè)離心管的病毒液分別接種PK－15細(xì)胞，測(cè)定其TCID50，病毒滴度降低2個(gè)數(shù)量級(jí)判為敏感，反之判為不敏感。

1.2.1.5 酸堿敏感性試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。取裝有TJ－1株培養(yǎng)物2mL的離心管6只，用0.1 mol／L HCl和 NaOH 調(diào) pH 至3、5、6、8、10、11，于37℃水浴作用1h，在接種細(xì)胞前將所有離心管中液體 pH 調(diào)至7.0，立即接種 PK－15 細(xì)胞，測(cè)定TCID50。試驗(yàn)重復(fù)3次，觀(guān)察pH對(duì)病毒效價(jià)的影響。

1.2.1.6 熱敏感性試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［6－7］進(jìn)行。取盛有TJ－1株培養(yǎng)物1mL的離心管6只，置于56℃水浴，分別于作用5、10、15、30、45、60min后，取出接種于PK－15細(xì)胞，測(cè)定其TCID50，病毒滴度降低2個(gè)數(shù)量級(jí)判為敏感，該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 免疫熒光試驗(yàn) 將滅菌飛片置于24孔板內(nèi)，每孔加入一定量的PK－15細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后，在每個(gè)飛片上接種TJ－1株，同時(shí)設(shè)不接毒細(xì)胞對(duì)照。取接毒24h～48h的飛片，用PBS緩沖液漂洗2次，置丙酮中固定20min后自然風(fēng)干，加入PRV熒光標(biāo)記抗體，37℃作用2h，再用PBS液沖洗，吸去飛片表面的水分，滴加500mL／L甘油碳酸鹽緩沖液，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)特性 將TJ－1株分別接種于PK－15、BHK－21和 Marc－145細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄病毒在3種細(xì)胞上的產(chǎn)生病變的情況。

1.2.4 雞胚絨毛尿囊膜接種 按照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。將TJ－1株接種于3枚10日齡雞胚絨毛尿囊膜，每枚接種0.2mL，同時(shí)用相同劑量的MEM維持液接種雞胚作為對(duì)照。雞胚置培養(yǎng)箱繼續(xù)孵化144h，每日照蛋2次，棄去24h死亡雞胚，觀(guān)察24h～144h死亡和未死亡的雞胚絨毛尿囊膜是否有痘斑形成。1.2.5 家兔人工感染試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。取TJ－1株的細(xì)胞培養(yǎng)物頸部皮下接種于3只家兔，每只注射1mL，空白對(duì)照家兔接種相同劑量的MEM維持液，兩個(gè)試驗(yàn)組分開(kāi)隔離飼養(yǎng)14d，每天觀(guān)察家兔的采食、體溫、精神狀態(tài)等情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒理化特性的測(cè)定

由表1可見(jiàn)，PRV TJ－1株經(jīng)乙醚、氯仿、胰蛋白酶處理后病毒滴度顯著下降，說(shuō)明病毒對(duì)這3種試劑均敏感；由圖1可見(jiàn)，該病毒在pH 5.0以下和8.0以上，TCID50明顯降低，在pH 5.0至8.0之間病毒較穩(wěn)定，TCID50變化幅度?。挥蓤D2可見(jiàn)，病毒在56℃條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度逐漸降低，至60min時(shí)病毒可被滅活。

表1 偽狂犬病病毒TJ－1株對(duì)乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性Table 1The sensitivity of PRV TJ－1strain to ethyl ether，chloroform and trypsin（TCID50／0.1mL）.

圖1 偽狂犬病病毒TJ－1株對(duì)酸堿敏感性Fig.1The sensitivity of PRV TJ－1strain to acid and alkali

圖2 偽狂犬病病毒TJ－1株對(duì)56℃熱滅活敏感性Fig.2The sensitivity of PRV TJ－1strain to heat－inactivation at 56 ℃

2.2 免疫熒光試驗(yàn)

用PRV熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)感染TJ－1株的PK－15細(xì)胞，在胞漿內(nèi)可見(jiàn)特異性的綠色熒光，而正常的PK－15細(xì)胞無(wú)熒光（圖3）。

2.3 病毒在3種細(xì)胞上的增殖特性

PRV TJ－1 株 在 PK－15、BHK－21 和 Marc－145細(xì)胞上均能生長(zhǎng)，但細(xì)胞病變存在明顯差異（圖4）。PK－15細(xì)胞接毒后早期可見(jiàn)細(xì)胞膨大，隨之細(xì)胞變性圓縮，繼而開(kāi)始脫落逐漸形成空斑病灶；BHK－21細(xì)胞接毒后感染細(xì)胞變性圓縮，有合胞體出現(xiàn)，細(xì)胞逐漸死亡脫落，形成分散病灶區(qū)；Marc－145細(xì)胞接毒后，早期可見(jiàn)細(xì)胞拉長(zhǎng)，隨之細(xì)胞變圓，細(xì)胞逐漸融合形成空斑，繼而逐漸脫落。試驗(yàn)中PK－15和BHK－21兩種細(xì)胞在18h～24h即可出現(xiàn)細(xì)胞病變，Marc－145在24h～28h出現(xiàn)細(xì)胞病變。

圖3 偽狂犬病病毒TJ－1株感染PK－15細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果（200×）Fig.3Immunofluorescence test result of PK－15cell inoculated with PRV TJ－1（200×）

圖4 偽狂犬病病毒TJ－1株在3種細(xì)胞上的細(xì)胞病變Fig.4CPE of PRV TJ－1strain on three cell lines

2.4 雞胚絨毛尿囊膜接種

接種TJ－1毒株后144h，雞胚均未死亡，4℃凍胚4h后觀(guān)察病變，可見(jiàn)雞胚絨毛尿囊膜水腫、增厚并有白色的痘斑，對(duì)照雞胚絨毛尿囊膜無(wú)異常病變（圖5）。

圖5 雞胚尿囊膜形成痘斑Fig.5 Pox spots on chick chorioallantoic membrane

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

接種TJ－1毒株細(xì)胞培養(yǎng)物3d后的兔子表現(xiàn)為奇癢，用嘴啃咬注射部位，使注射部位被毛脫落，皮膚受損，繼而死亡。而注射MEM維持液對(duì)照家兔無(wú)異常變化。

3 討論

偽狂犬病是多種家畜和野生動(dòng)物的一種重要的病毒性傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。德國(guó)、瑞典、奧地利、英國(guó)和丹麥等已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了PR的凈化，在我國(guó)近些年隨著偽狂犬病病毒基因缺失疫苗和gE－ELISA抗體檢測(cè)方法的使用［10］，已鮮有大規(guī)模發(fā)病的報(bào)道。在天津地區(qū)某豬場(chǎng)筆者分離到了偽狂犬病病毒，說(shuō)明仍需重視該病的防控，特別是大型養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)定期對(duì)豬群進(jìn)行監(jiān)測(cè)，制定凈化方案而消滅本病。本文對(duì)偽狂犬病病毒天津（TJ－1）分離株的主要生物學(xué)特性進(jìn)行分析，結(jié)果將為該毒株的深入研究奠定基礎(chǔ)。

本研究對(duì)偽狂犬病病毒TJ－1株的理化特性分析表明，該毒株對(duì)乙醚、氯仿、胰蛋白酶均敏感，在pH 5至8之間病毒較穩(wěn)定，而當(dāng)pH為3或者11時(shí)，病毒在37℃1h可以被滅活。此外，該毒株對(duì)熱有一定的抵抗力，病毒在56℃條件下，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，病毒滴度逐漸降低。本文試驗(yàn)數(shù)據(jù)與陳陸等報(bào)道的偽狂犬病病毒Fa株的理化特性相似，但TJ－1株在耐熱性方面較弱，置于56℃ 經(jīng)60min病毒可被滅活。

偽狂犬病病毒為皰疹病毒屬病毒，具有廣嗜性，研究報(bào)道該病毒能在多種細(xì)胞上增殖［11－13］。為了解TJ－1株的細(xì)胞增殖特性，本文將其接種于PK－15、BHK－21和Marc－145細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株在3種細(xì)胞上均可增殖。3種細(xì)胞相同的細(xì)胞病變主要為細(xì)胞變圓，形成散在病灶，繼而逐漸擴(kuò)散至全部細(xì)胞，細(xì)胞溶解脫落。但是3種細(xì)胞產(chǎn)生病變的時(shí)間不同，而且只在BHK－21細(xì)胞觀(guān)察到了多核合胞體。

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