董雷鳴，沈登鋒，喻衛(wèi)武，曾燕如，吳智敏，戴文圣

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省龍泉市林業(yè)局，浙江 龍泉 323700）

榧樹Torreya grandis隸屬于紅豆杉科Taxaceae榧樹屬Torreya，雌雄異株，稀同株，天然分布于江蘇南部、浙江、福建北部、江西北部、安徽南部、湖南西南部及貴州松桃等地[1]，其中的香榧T.grandis‘Merrillii’是榧樹中優(yōu)良變異類型經(jīng)無性繁殖培育而成的唯一優(yōu)良品種[2]，其種子是中國重要的干果之一。由于香榧極高的經(jīng)濟價值，作為浙江省重要的經(jīng)濟樹種之一，多年來有關(guān)榧樹的研究多集中在有關(guān)香榧的生物學(xué)特性[3]、 病害[4]、林地土壤養(yǎng)分[5]、栽培管理技術(shù)[6-7]、無性繁殖技術(shù)[8-10]、 假種皮化學(xué)物質(zhì)的提取方法[11]、假種皮提取物的成分分析和藥理作用[12]等，僅在近幾年才基于選育種的需求，對榧樹開展了一些研究。研究發(fā)現(xiàn)，雌性榧樹營養(yǎng)體、產(chǎn)量以及榧籽種實和化學(xué)成分等天然種群內(nèi)和種群間均存在較大的差異[13]，存在著極其豐富的遺傳多樣性[14-15]，其中不乏一些綜合性狀優(yōu)良、種子品質(zhì)達到或超過香榧的優(yōu)株[16-17]。榧樹雌雄異株的特性對其遺傳多樣性做出了重要貢獻，但是關(guān)于雄性榧樹的研究則鮮有報道。雄性榧樹的性狀如花粉量的多少、始花期及花期的長短等，是香榧生產(chǎn)中雌雄配置的理論依據(jù)。本文是對雄性榧樹葉片形態(tài)、球花大小、開花時間、花粉量及花粉形態(tài)初步研究結(jié)果的報道，對今后榧樹雄株選擇、香榧新造林雌雄株配置、榧樹多樣性保護具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 采樣地點

2009年4月采集試驗用榧樹葉片及雄球花。采樣區(qū)位于浙江省淳安縣與臨安市交界處，29°11′～30°02′N， 118°20′～119°20′E； 海拔約為 560 m； 年平均氣溫為 17.8℃， 年極端最低氣溫-13.3℃， 年極端最高氣溫40.7℃；年降水量為1425.7mm。該區(qū)域榧樹雄株分布較為集中，且受人為干擾少，基本保持了野生狀態(tài)。同時，在當?shù)剡M行雄球花開花期觀測。

花粉形態(tài)觀測用樣品采自浙江省臨安市湍口鎮(zhèn)洪嶺村、淳安縣臨岐鎮(zhèn)朱塔村、諸暨市、嵊州市。授粉試驗用的花粉采自浙江省嵊州市、臨安市和淳安縣，選擇生長勢良好，樹齡在50～80 a間的榧樹雄株。

1.2 方法

1.2.1 采樣 選擇樹齡30～50 a，憑經(jīng)驗評估雄花量為中等以上，生長旺盛、長勢均一，無明顯病蟲害的榧樹雄株為樣本株，共60株，分別編號。采樣時仔細挑選著生在樹木中部粗壯大枝上無病害，葉片整齊均勻，帶有雄球花的1年生幼枝，采集15個·株-1，置于封口塑料袋中帶回實驗室。

1.2.2 葉片性狀測定 選取大小均一的小枝，由枝條基部起同側(cè)連續(xù)取5片小葉，分別測定葉長、葉寬（葉片最寬處）及葉片厚度（5片小葉總厚度的平均值），測量時注意葉片平展，并計算葉形指數(shù)（葉寬/葉長）、標準差、變異系數(shù)、Pearson相關(guān)指數(shù)。

1.2.3 雄球花性狀的測定 隨機選取15個球花，用游標卡尺測量每個球花的縱徑、橫徑并稱量，計算球花形指數(shù)（橫徑/縱徑）。然后置于硫酸紙上，待花粉充分散出后（2 d），抖盡球花中的花粉并稱量。然后計算出粉率，出粉率（%）=（花粉質(zhì)量/球花質(zhì)量）×100。

1.2.4 開花時間觀察 觀察并記錄各個樣本株的球花始花時間。

1.2.5 花粉電鏡掃描 使用掃描電鏡（荷蘭飛利普XL30-ESEM）觀察不同地點采集的雄株花粉形態(tài)。

1.2.6 香榧授粉試驗 2010年4月下旬在浙江省臨安市選擇進入盛果期不久的香榧單株為試驗材料，于雌花開放前用硫酸紙袋套袋，套袋36個·株-1，以單株為重復(fù)，重復(fù)3次。2010年4月17-25日，在浙江省嵊州市、臨安市、淳安縣各采集3株即將開放的榧樹雄花枝，分單株編號。室內(nèi)晾曬出的花粉分單株收集，并放入干燥器置于4℃冰箱保存。4月底（4月29日）雌花大量開放（授粉滴呈圓珠狀）的第3天，單面打開硫酸紙袋，統(tǒng)計雌花數(shù)后用毛筆蘸施花粉，后再次封閉硫酸紙袋。2 d后重復(fù)同一過程。授粉5 d后去袋，2個月后統(tǒng)計幼果數(shù)，計算坐果率。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄株葉片性狀的變異

從統(tǒng)計數(shù)據(jù)（表1）可以看出：榧樹雄株葉片的長、寬、厚均存在一定變異，其中葉片長度最長3.20 cm，最短1.53 cm，最長葉片約為最短葉片長度的2倍，平均為2.12 cm；葉寬集中在0.28～0.39 cm范圍內(nèi)，平均為0.32 cm；葉片厚度變異也較大，最大值為0.32mm，最小為0.17mm，平均為0.23mm。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）以葉片長度最大，為14.99%；葉厚變異系數(shù)略小于葉片長度的變異系數(shù)；葉寬最小，為8.83%。葉長與葉寬及葉厚在0.01水平顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.563和0.360；葉寬和葉厚相關(guān)性不顯著（表2）。一般而言，不同植物葉片的形態(tài)大小千差萬別，同種植物的葉片形態(tài)也會因遺傳背景[18]、生境[19]，甚至是葉序[20]的不同而有所差異。本研究中不同榧樹雄株單株的葉片長度的最大值和最小值相差近1倍，由于樣株采自一地，長勢均一，因此葉片形態(tài)上的差異是由各自的遺傳特性決定的。

表1 榧樹雄株葉片、球花表型特征值Table1 Phenotypical values of leaves and male cone-shaped flowers in Torreya grandis

2.2 雄球花性狀的變異

從研究結(jié)果看，單株間雄球花縱徑有較大的變異，最大為1.32 cm，最小0.49 cm，最長的球花約為最小的3倍，平均約為0.79 cm，變異系數(shù)為23.48%；球花橫徑變異小于縱徑，最大值為0.54 cm，最小為0.32 cm，均值為0.42 cm，變異系數(shù)為10.60%；球花質(zhì)量為0.33～2.66 g，平均質(zhì)量為1.19 g；花粉凈質(zhì)量為0.051～0.548 g，最大值約為最小值的10倍，平均單個球花內(nèi)花粉質(zhì)量為0.170 g，變異系數(shù)為55.29%，為各指標之最；出粉率最大為38.03%，最低5.05%，相差7倍之多，平均出粉率較高，約13.89%（表1）。對各指標進行Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗，發(fā)現(xiàn)榧樹雄球花橫徑與縱徑呈極顯著性相關(guān)（0.625，P＜0.01）；球花橫徑與球花質(zhì)量及花粉質(zhì)量呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.619和0.431；球花質(zhì)量與花粉質(zhì)量相關(guān)系數(shù)為0.739，花粉質(zhì)量與出粉率相關(guān)系數(shù)為0.749，均達到極顯著水平。其余指標則相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

表2 雄株葉片各指標相關(guān)性系數(shù)Table2 Correlation coefficients among indexes of leaves in male Torreya grandis

表3 榧樹雄球花及花粉各指標之間相關(guān)系數(shù)Table3 Correlation coefficients among indexes of male flowers and pollen in Torreya grandis

2.3 雄球花始花期的變異

從相同地點、相近海拔的雄花始花時間（圖1）看，最早的為4月16日，最遲的4月22日，相差近1周，集中開放于4月16-18日，其中4月17日始花的最多，為26株；16-18日開始開花的共43株，占觀測樣本株（56株）的76.8%（由于樣本株分布較為分散，4個樣本株未觀測到始花）。了解榧樹開花時間的差異對香榧生產(chǎn)、香榧林的營建生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義，因為榧樹雌花并非集中開放，在混合芽開展的數(shù)天內(nèi)，陸續(xù)有雌花成熟，并且雌花有等待授粉的習性。所以，造林時配置始花期早、中、晚不一的授粉樹，有利于雌花充分授粉，而且特別應(yīng)該適當配置晚花類型的雄株。

圖1 不同始花期的雄株數(shù)Figure1 Number of male Torreya grandis trees starting to bloom at different times

2.4 花粉形態(tài)觀察

從榧樹花粉的電鏡掃描圖像（圖2）可以看出：榧樹花粉單粒，近球形，直徑為22～26μm；外壁表面呈顆粒狀，上具有稀疏、大小不均的顆粒狀凸起；無溝孔。不同地點或同一地點不同單株采集的花粉在表觀上無明顯差異，這與一般認為的一種植物花粉形態(tài)具有很強遺傳保守性的觀點是吻合的[21-22]。

2.5 不同產(chǎn)地榧樹花粉對香榧的授粉試驗

幼果坐果率在很大程度上決定了香榧的產(chǎn)量。授粉試驗結(jié)果（表4）表明：以嵊州雄株花粉所授雌花坐果率最高，為34.10%；臨安與淳安花粉坐果率次之，分別為26.53%和25.61%。3地花粉坐果率的方差分析及多重比較顯示，不同產(chǎn)地的花粉在授粉試驗中差異顯著（P=0.016）；臨安與淳安花粉的幼果坐果率無顯著差異，而嵊州花粉授粉的幼果坐果率顯著高于臨安與淳安花粉。

表4 不同雄株花粉的授粉結(jié)果比較Table4 Comparison among the results of pollination with pollen from different male trees

3 討論

榧樹雄株的葉片和球花各指標單株間均存在變異，兩性狀分別以葉片長度和花粉質(zhì)量差異最為顯著，變異系數(shù)分別達到14.99%和55.29%。這與其生物學(xué)特性是密切相關(guān)的。雌雄異株、風媒授粉、生活史長的樹種均有此特點[23-24]。變異是育種的基礎(chǔ)。變異系數(shù)越大，說明單株間的表型差異越顯著，多樣性越豐富，優(yōu)株選育時可供選擇的潛力越大。

圖2 榧樹花粉掃描電鏡照片（從左至右放大倍數(shù)：500×，2500×，8000×；從上至下：1諸暨，2嵊州，3臨安，4淳安，其中淳安4a和4b為2個單株）Figure2 Morphological photos of pollen scanned through scanning electron microscope in Torreya grandis （From left to right： 500×， 2500×and 8000×； from up to down： pollen from Zhuji （1）， Shengzhou （2）， Lin’an （3）， and Chun’an （4）； 4a and 4b are the pollens from 2 sampled trees in Chun’an）

本研究中榧樹雄株葉長同葉寬呈極顯著正相關(guān)，而在葉寬差異不十分明顯的條件下，葉片長度越長，則意味著葉面積越大，單位時間內(nèi)的光合速率有可能較大，這樣有助于樹木營養(yǎng)生長，提高它對自然環(huán)境的適應(yīng)能力，同時也可能有利于榧樹營養(yǎng)的生殖分配。然而本研究結(jié)果表明，葉長與每個雄球花的花粉質(zhì)量、出粉率相關(guān)不顯著（相關(guān)系數(shù)分別為-0.035和-0.037）。植物的營養(yǎng)生長與生殖生長關(guān)系復(fù)雜，彼此間存在碳/氮平衡關(guān)系。因此，不能簡單地用葉片大小來反映生殖器官生產(chǎn)力的大小，也即它們之間的相關(guān)性，盡管營養(yǎng)器官與生殖器官間存在庫與源、庫對源營養(yǎng)分配具有拉動的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，雄株葉片的長度范圍（1.53～3.20 cm）也比康寧等[1]描述的榧樹葉片長度范圍（1.1～2.5 cm）要大。康寧等在對榧樹及榧屬其他種進行分類時首先采用的是種子性狀，再依次基于枝條及葉片性狀進行分類，對葉片長度的描述未分別雌雄株。

本研究雄株生殖器官的變異比營養(yǎng)器官的變異要大，在雌株中也有類似的情況[25]。球花大小、球花質(zhì)量、花粉的多少都是進行雄性授粉優(yōu)株選擇時可以做出直觀判斷的憑據(jù)。在香榧林地配置雄株，或雄株嫁接育苗，或?qū)⑿壑杲铀爰藿拥酱浦晟?，或者將雄株用于今后的育種工作，花粉量大的雄株都是應(yīng)予以優(yōu)先考慮的對象。榧樹雄球花花期短而雌球花花期長，香榧雌株單株花期為15～20 d[26]。為達到香榧充分授粉提高產(chǎn)量的目的，必須配置不同花期的雄株。本研究中雄花始花期相差約1周時間，并且集中開放于前3 d，應(yīng)當特別關(guān)注開花較晚的單株。不同來源的榧樹花粉外部形態(tài)基本一致，然而同屬裸子植物的銀杏Ginkgo bioloba則在花粉形態(tài)上表現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性[27]，說明花粉形態(tài)因物種而異。

高產(chǎn)是經(jīng)濟林栽培的三大目標之一，而提高坐果率是有效途徑之一?；ǚ壑备惺歉副净ǚ蹖ΨN子或果實發(fā)育及性狀的影響[28]，多種果樹中都存在該現(xiàn)象[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，榧樹也具有花粉直感現(xiàn)象，不同產(chǎn)地的花粉對香榧的坐果率有顯著影響。該結(jié)果有助于發(fā)掘更多優(yōu)良的榧樹雄株，為榧樹優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

由于榧樹的種實是經(jīng)濟產(chǎn)量的主要體現(xiàn)，以往的研究多集中在對雌株的研究上，對雄株的研究鮮有報道，但雄株對榧樹遺傳多樣性方面的貢獻很大。本研究只是雄性榧樹研究的初步結(jié)果。今后，本研究小組將進一步通過不同雄株花粉對不同香榧單株的雙列雜交來研究榧樹雄株的花粉直感作用，并從DNA水平入手研究雄性榧樹的遺傳多樣性。所有這些研究將為榧樹雄株選擇提供理論依據(jù)。

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