馮志新，劉茂軍，熊祺琰，華利忠，王海燕，甘 源，韋艷娜，蘇國東，2，邵國青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染?。?］。本病遍布全球，并且易與其他病原發(fā)生混合感染，引起更嚴(yán)重的肺部病變，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟損失［2－3］。為控制該病以降低生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)殖績效，目前臨床上最為廣泛使用的兩種辦法是藥物防治與疫苗免疫。一些藥物可有效地抑制豬肺炎支原體的生長，降低肺部損傷，曾對豬支原體肺炎的控制起過重要作用［4］。然而，藥物的使用并不能完全清除體內(nèi)已感染的豬肺炎支原體，從長遠(yuǎn)考慮并不能達(dá)到根治的目的。另外，長期的藥物使用所引發(fā)的耐藥性和抗生素殘留已成為豬場保健中存在的一大難題。接種疫苗是控制豬支原體肺炎的另一重要策略。目前，市場上可供選擇的疫苗主要為進(jìn)口滅活疫苗和國產(chǎn)弱毒疫苗。Thacker等［5］研究表明，豬支原體肺炎滅活疫苗免疫后由于不能阻止豬肺炎支原體野毒對支氣管纖毛的定植，因此無法產(chǎn)生完全的保護(hù)。進(jìn)一步研究表明，豬體全身的細(xì)胞免疫和局部的黏膜免疫機制對抵抗并清除豬肺炎支原體的感染起著關(guān)鍵的作用［6－9］。豬支原體肺炎活疫苗(168株)是當(dāng)前國內(nèi)唯一大量推廣使用的弱毒疫苗，臨床使用效果顯著。實驗室的攻毒保護(hù)試驗表明，其保護(hù)效率要高于進(jìn)口滅活疫苗。本試驗重點研究豬支原體肺炎活疫苗免疫后產(chǎn)生的機體免疫反應(yīng)，尤其是豬體細(xì)胞免疫和黏膜免疫反應(yīng)水平，以及疫苗免疫后對豬呼吸道氣管纖毛上皮細(xì)胞的影響，從免疫機制方面對該活疫苗的免疫效果進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 材料 豬支原體肺炎活疫苗(168株)，批號109039，南京天邦生物科技有限公司;5～10日齡豬肺炎支原體陰性的健康仔豬。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 選取4窩5～10日齡Mhp陰性的健康哺乳仔豬，每窩8～10頭仔豬，隨機分成兩組，每組兩窩，隨母豬隔離飼養(yǎng)。其中一組每頭豬按疫苗說明書要求，肺內(nèi)注射豬支原體肺炎活疫苗(168株)1頭份;另外一組每頭肺內(nèi)注射1 mL PBS緩沖液作對照。于免疫后第0、7、14、21、28天采集鼻拭子分別檢測Mhp特異性SIgA抗體和IFN－γ;于相同時間段采集血清，檢測Mhp特異性IgG抗體;分別于免疫后第14天和第28天每組隨機選取5頭豬采集抗凝血3 mL/頭，用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測;于免疫后第28天每組剖殺3頭豬，采集支氣管上皮組織，用于掃描電鏡觀察纖毛狀態(tài)以及通過原位雜交方法檢測疫苗株的占位效應(yīng)。

1.2.2 Mhp特異性SIgA抗體檢測 將采集的鼻拭子樣品浸液在4℃過夜，第二天在渦旋振蕩器上震蕩5 s后，盡量吸出鼻拭子浸液，10000 r/min離心5 min，取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩⒄找褕蟮赖奈墨I(xiàn)方法［10］檢測Mhp特異性SIgA抗體滴度。

1.2.3 Mhp特異性IgG抗體檢測 按豬肺炎支原體抗體ELISA檢測試劑盒(IDEXX Co，USA)說明書檢測血清樣品中Mhp特異性IgG抗體滴度。

1.2.4 豬IFN－γ 檢測 鼻拭子樣品按1.2.2項處理。按羊抗豬IFN－γ ELISA檢測試劑盒說明書檢測鼻拭子樣品中豬IFN－γ滴度。

1.2.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測 分別于免疫后第14天和第28天，每頭豬無菌采集3 mL抗凝血。參照已報道的文獻(xiàn)方法［11］檢測特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并計算刺激指數(shù)SI值。

1.2.6 掃描電鏡觀察纖毛狀態(tài) 于免疫后第28天每組剖殺3頭豬，取出肺臟，切開支氣管，經(jīng)0.1 mol/L無菌PBS溶液泡洗去除雜質(zhì)和粘液后剪成約5 mm×5 mm大小塊狀，剪切時小心不能損傷支氣管內(nèi)表面。將支氣管小塊用2.5%的磷酸緩沖戊二醛固定液4℃固定過夜;0.1 mol/L PBS清洗3次，每次15 min;乙醇系列脫水后移入丙酮;經(jīng)醋酸異戊酯替代后，將標(biāo)本置于二氧化碳臨界點干燥儀中干燥;再在真空涂膜儀內(nèi)噴金，用電子掃描鏡(HITACHI，S－3000N，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實驗室提供)進(jìn)行觀察。

1.2.7 Mhp原位雜交檢測 于免疫后第28天每組剖殺3頭豬，采集含支氣管的肺組織樣品，將樣品切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的小塊于10%中性福爾馬林溶液中固定。參照已報道的文獻(xiàn)方法［12］，對支氣管組織中疫苗株進(jìn)行原位檢測。

2 結(jié)果

2.1 免疫后呼吸道Mhp特異性SIgA抗體檢測分別于免疫后第 0、7、14、21、28 天采集鼻拭子，檢測呼吸道中Mhp特異性SIgA抗體滴度，結(jié)果如圖1所示。試驗豬肺內(nèi)免疫豬支原體肺炎活疫苗后，鼻腔中Mhp特異性SIgA抗體持續(xù)上升，至免疫后第21天升至最高，免疫后第28天滴度略微下降;而未免疫對照組的試驗豬始終未有Mhp特異性SIgA抗體產(chǎn)生?；钜呙缑庖吆蠹せ盍撕粑谰植康酿つっ庖叻磻?yīng)。

圖1 豬支原體肺炎活疫苗肺內(nèi)免疫后呼吸道特異性SIgA滴度檢測

2.2 免疫后血清中Mhp特異性IgG抗體檢測 分別于免疫后第 0、7、14、21、28天采集血清，檢測血液中Mhp特異性IgG抗體滴度。整個試驗周期中均未有陽性值檢出，說明活疫苗免疫后未能激活機體產(chǎn)生循環(huán)抗體。

2.3 免疫后呼吸道IFN－γ檢測 分別于免疫后第0、7、14、21、28 天采集鼻拭子，檢測呼吸道中IFN －γ濃度，結(jié)果如圖2所示。試驗豬肺內(nèi)免疫豬支原體肺炎活疫苗后，鼻腔中IFN－γ濃度持續(xù)上升，在免疫后14～28 d維持在較高水平;而未免疫對照組的試驗豬鼻腔中的IFN－γ濃度始終保持較低水平?；钜呙缑庖吆?，呼吸道局部的細(xì)胞免疫也被活化。

2.4 免疫后血液中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測 分別于免疫后第14天與第28天，每頭豬無菌采集3 mL抗凝血，分離淋巴細(xì)胞后，用豬肺炎支原體全菌蛋白刺激培養(yǎng)，計算免疫組與對照組的刺激指數(shù)，如圖3所示。免疫組試驗豬在免疫后第14天與第28天，血液中淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)分別為1.52與2.01，均與對照組差異明顯(P＜0.05)，疫苗免疫后激活了全身細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.5 免疫后支氣管纖毛上皮細(xì)胞觀察 于免疫后第28天每組剖殺3頭豬，取支氣管上皮組織固定后，用掃描電鏡觀察上皮纖毛細(xì)胞的狀態(tài)如圖4所示。免疫組與未免疫組試驗豬的支氣管纖毛上皮細(xì)胞均細(xì)長而整齊。其中免疫組試驗豬的支氣管纖毛未出現(xiàn)變粗、凝集、脫落等病變，但在纖毛頂端、中部或底部有較多的球狀黏附物發(fā)現(xiàn)。該實驗結(jié)果說明，活疫苗免疫對豬的支氣管纖毛是安全的。

圖4 豬肺炎支原體強毒攻毒后支氣管纖毛掃描電鏡圖

2.6 免疫后支氣管上皮細(xì)胞上疫苗株的占位檢測于免疫后第28天每組剖殺3頭豬，取支氣管上皮組織固定后，用原位雜交的方法，檢測呼吸道上皮細(xì)胞表面的疫苗株。如圖5所示，免疫組試驗豬的支氣管上皮細(xì)胞表面出現(xiàn)棕色深染信號，而未免疫對照組試驗豬的樣品中未有相似信號發(fā)現(xiàn)。利用原位雜交的方法成功地檢測到了活疫苗對支氣管上皮細(xì)胞的占位效應(yīng)。

圖5 豬肺炎支原體P36探針原位雜交檢測圖

3 討論

前期研究［11］對豬支原體肺炎活疫苗免疫后的攻毒保護(hù)效果進(jìn)行了動物試驗，同時也檢測了相關(guān)的免疫學(xué)指標(biāo)。本研究著重對活疫苗免疫后機體所產(chǎn)生的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫作了系統(tǒng)檢測與評價，同時也對疫苗免疫后對豬呼吸道纖毛上皮細(xì)胞的安全性進(jìn)行了評價。在免疫學(xué)指標(biāo)檢測方面，本次研究的結(jié)果與前期研究數(shù)據(jù)基本一致。其中，本研究中特異性SIgA滴度在21 d達(dá)到最高，隨后略有所下降，IFN－γ濃度是上升到14 d后基本保持穩(wěn)定;而我們的前期研究結(jié)果表明，SIgA滴度可一直上升到60 d，IFN－γ濃度可上升至45 d后保持穩(wěn)定，其中原因可能是本次研究的檢測時間只檢測到了免疫后第28天，并未對后期進(jìn)行檢測分析。但從免疫后同期的檢測數(shù)據(jù)來看，兩次試驗結(jié)果差異不大，而且總體的分泌趨勢是一致的。結(jié)果證實，豬支原體肺炎活疫苗免疫后，有效地激活了全身的細(xì)胞免疫與局部的黏膜免疫，但體液免疫反應(yīng)未有檢出。另外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)也曾用我們的活疫苗菌株配合CpG佐劑通過滴鼻方式免疫試驗豬［13］，檢測發(fā)現(xiàn)支氣管表面的黏膜免疫與細(xì)胞免疫獲得激活。結(jié)合我們前期攻毒保護(hù)試驗的研究數(shù)據(jù)，再一次驗證了豬支原體肺炎活疫苗良好的免疫保護(hù)效果與激活豬體的細(xì)胞免疫與黏膜免疫反應(yīng)相關(guān)，這與國外關(guān)于機體對豬肺炎支原體抗感染的研究結(jié)果相符［6－9］。

豬肺炎支原體對豬呼吸道的感染主要通過P97蛋白等黏附因子定植于氣管與支氣管的纖毛上皮細(xì)胞上，并對纖毛細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使纖毛發(fā)生破損、脫落，在引起肺部炎癥的同時，破壞豬呼吸道的物理屏障，引起一系列的繼發(fā)感染。對于豬肺炎支原體對纖毛細(xì)胞的損傷作用，本研究曾將豬肺炎支原體組織強毒感染的支氣管纖毛組織進(jìn)行了電鏡掃描觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的纖毛發(fā)生了變粗、凝聚和脫落現(xiàn)象，證實了上述致病機理。活疫苗免疫研究中，通過支氣管纖毛細(xì)胞的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，活疫苗免疫豬的纖毛細(xì)胞上有球狀黏附物，結(jié)合原位雜交的試驗結(jié)果分析，黏附在纖毛上的球狀物可能是疫苗菌株;但免疫組與未免疫組的纖毛形態(tài)正常，細(xì)胞狀態(tài)無差異，說明疫苗可以在纖毛上黏附，但不會對纖毛細(xì)胞產(chǎn)生上述損傷作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體活疫苗可在免疫豬的呼吸系統(tǒng)纖毛上皮細(xì)胞黏附和定殖，并顯著提升豬體淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)、IFN－γ和Mhp特異性SIgA抗體水平。由于支原體特有的免疫逃避機理［14］，疫苗株可能在免疫豬的呼吸道表面產(chǎn)生較長時間的占位效應(yīng)和個體保護(hù)，這符合活疫苗(168株)一次免疫而保護(hù)期較長的特性。鑒于疫苗菌株的占位效應(yīng)和支原體空氣傳播能力［15］，長時間活疫苗免疫將使疫苗株與野毒株對其共同靶細(xì)胞及生存環(huán)境產(chǎn)生競爭而起到保護(hù)作用。

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