河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物治療科 汪治宇 王聰敏 王 娟

引言

胰腺癌是西方世界第五大致死性癌癥，其5年總生存率小于5%[1]。胰十二指腸切除術(shù)是治愈胰腺癌唯一的手段，但確診患者中只有10%～15% 適合手術(shù)治療。應(yīng)用吉西他濱化療是目前治療晚期胰腺癌最有效的方法，其生存率相較于應(yīng)用5-氟尿嘧啶(5-FU)治療有中度升高[2,3]。近來實驗中尚無證據(jù)表明吉西他濱聯(lián)合其他化療藥物可提高生存率[4]，因此我們需要找尋治療晚期胰腺癌的新策略。胰腺癌細胞可以被腫瘤特異性T細胞識別[3-6]，而且腫瘤被細胞毒性T細胞(CTLs)及輔助性T細胞浸潤是胰腺癌病人良好的預(yù)后因素[7]?？梢种颇[瘤的腫瘤反應(yīng)性T細胞也可以從胰腺癌患者血液中分離出來[8]。

樹突狀細胞(DCs)瘤苗接種可激活腫瘤特異性T細胞[9,10]。DCs是具有獨特的建立初級免疫反應(yīng)能力的專門的抗原提呈細胞[11]。DCs可將外源性抗原呈遞給主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)，進而形成激活CTLs的通路，這個過程稱為“交叉遞呈”[12]。接觸微生物的或炎性“危險信號”也可以像接觸T細胞源性激活信號那樣誘導(dǎo)DC成熟及白介素(IL)12分泌[13,14]。IL-12在調(diào)節(jié)腫瘤定向免疫反應(yīng)及通過激發(fā)自然殺傷(NK)細胞、CTLs及干擾素(IFN)γ來產(chǎn)生1型輔助性T細胞(Th1)的過程中起中心作用。接種負載腫瘤抗原的DCs瘤苗已被證實可以誘導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤的CTL反應(yīng)，并且可誘發(fā)癌癥病人的腫瘤縮小[9,15-17]。接種負載腫瘤抗原的DCs瘤苗后，胰腺癌細胞在體內(nèi)會被排斥[18,19]，然而腫瘤能夠在其周圍構(gòu)建一個對CTLs不敏感的免疫抑制環(huán)境。與其他治療策略如放化療聯(lián)合可打破癌細胞的免疫抵抗并可增強DC瘤苗接種的療效。

吉西他濱不僅發(fā)揮直接的抗腫瘤活性，還可以介導(dǎo)與腫瘤免疫治療相關(guān)的免疫學(xué)效應(yīng)[20-22]。經(jīng)吉西他濱在內(nèi)的多種藥物治療后，CTL反應(yīng)也可通過DCs交叉遞呈腫瘤細胞抗原而誘發(fā)[23]。吉西他濱治療可促進DCs對腫瘤抗原的交叉遞呈，這也提高了體內(nèi)CTLs對腫瘤的識別能力[24]。近來，我們證實了吉西他濱可增加人類胰腺癌細胞對DC誘導(dǎo)的腫瘤特異性CTL反應(yīng)的敏感性[25]。本實驗中，我們應(yīng)用胰腺癌小鼠模型來研究吉西他濱是否可以提高樹突狀細胞瘤苗體內(nèi)接種的療效。

1 材料與方法

1.1 小鼠，細胞株和培養(yǎng)液

動物實驗由德國慕尼黑Regierung von Oberbayern批準。C57BL/6小鼠來自Harlan Winkelmann(博爾興，德國)。C57BL/6背景的轉(zhuǎn)基因OT-1動物由Brocker 教授提供(慕尼黑大學(xué)免疫學(xué)系)。OT-1 T細胞生長于含10%胎牛血清(FCS;Gibco,Invitrogen公司，Paisley，英國)、青霉素及鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液(Biochrome，柏林，德國)中。H2-b陽性細胞株P(guān)ancO2來源于C57BL/6 小鼠體內(nèi)被甲基苯蒽誘發(fā)的胰腺癌[26,27]。PancO2細胞保存在含10%FCS、2mML-谷氨酰胺(生命技術(shù)公司，Paisley，英國)、100U/ml青霉素(Sigma，慕尼黑，德國)及100μg/ml鏈霉素(Seromed,Julich,德國)的RPMI培養(yǎng)液中。在與DCs共同培養(yǎng)之前，PancO2已被紫外線B以0.75J/cm2的強度照射過。經(jīng)紫外線照射后仍存活的腫瘤細胞通過光學(xué)顯微鏡及胸苷摻入法被排除。H2-Kb陽性淋巴細胞株EL4(由Enders教授，Institut fur Chirurgische Forschung，慕尼黑大學(xué)，惠贈)保存在含10%FCS、青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。

1.2 mRNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR

標(biāo)本先在磷酸緩沖液(PBS)中清洗，然后在液氮中冰凍切片并儲存在-70℃的環(huán)境中。采用均質(zhì)勻漿儀(Janke und Kunkel，施陶芬，德國)對組織進行均勻退火，然后應(yīng)用羅氏總RNA組織提取試劑盒(羅氏，曼海姆，德國)分離總RNA。RNA儲存于等容量的酒精中并置于－80℃的環(huán)境中。通過光譜分析檢測RNA的收率及純度。反轉(zhuǎn)錄運用了M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco 生命技術(shù)公司，Paisley，英國)、RNA酶抑制劑(羅氏，曼海姆，德國)以及dNTP(Promega，麥迪遜，德國)。PCR應(yīng)用了Taq DNA聚合酶并按照供應(yīng)商(羅氏，曼海姆，德國)推薦的方式進行。引物采用Applied Biosystems(Weiterstadt，德國)根據(jù)文獻提供的序列研制而成[28]。

1.3 單克隆抗體及流式細胞術(shù)

為進行表型分析，DCs與5μg/2×105細胞抗小鼠CD86-FITC單克隆抗體(mAb；克隆GL1)、CD11b-PerCP mAb(克隆 M1/70)、CD11c-APC mAb(克隆HL3；全部來自BD Biosciences公司，SanJose，認證中心，美國)、MHCⅡ-PE mAb(克隆 NIMR-4，南方生物技術(shù)公司，伯明翰，AL，美國)以及合適的同型對照一起在4℃的環(huán)境中培養(yǎng)30min。細胞采用流式細胞術(shù)(FACSCalibur，BD Biosciences，海德爾堡，德國)檢驗。應(yīng)用CellQuest軟件(BD Biosciences，海德爾堡，德國)分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用抗小鼠mAb(H2-Kb，克隆AF6-88.5；和H2-Db，克隆KH95，二者均來自BD Biosciences，San Jose，CA，美國)檢測MHCⅠ的表達。

1.4 肽

H2-Kb限制性抗原肽OVA257-264、TRP2181-188以及p15E604-611均來自Peptide Technologies(柏林，德國)[29-31]。

1.5 試劑

吉西他濱來自Lilly(Indianapolis，IN，美國)。咪達唑侖(Roche，巴塞爾，瑞士)，medetomidin(Orion公司，Espoo，芬蘭)，芬太尼(Janssen-Cilag，諾伊斯，德國)以及納洛酮(Deltaselect，Dreieich，德國)被用來麻醉。

1.6 細胞因子、生長因子、刺激劑和ELISAs

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、IL-1β、IL-2以及IL-4來自PeproTech(倫敦，英國)，IFNα來自HyCult Biotechnology(Uden，荷蘭)。內(nèi)毒素(LPS)，p:IC，R848和腫瘤壞死因子α(TNFα)均來自Sigma-Aldrich(Steinheim，德國)。IL-12p70、IL-12p40和IFNγ的小鼠ELISA試劑盒均來自BD Biosciences(San Diego，CA，美國)。

1.7 骨髓源性DCs的生成及其抗原負載

如述制備骨髓源性DCs[32]。骨髓細胞采集自小鼠的股骨和脛骨。將紅細胞溶解于氯化銨緩沖液(BD Biosciences，海德爾堡，德國)。細胞以5×105個/cm2的密度培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，并向培養(yǎng)液中加入10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml鏈霉素、1IU/ml青霉素、20ng/ml GM-CSF以及20ng/ml IL-4(DC培養(yǎng)液)。7天后可獲得粘連松散的細胞，通過熒光激活細胞分選器(FACS)對DC標(biāo)記的表達進行量化。DCs占制備細胞的70%。以DC/腫瘤細胞比值為10:1的比例將DCs與PancO2(后文被稱作“激發(fā)”)細胞共同培養(yǎng)，最后24h加入LPS(250ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)。九天后可-獲得粘連松散的細胞，沖洗后置于RPMI中再懸浮并通過FACS進行分析。

1.8 腫瘤誘發(fā)及瘤苗接種策略

作為預(yù)防性接種，最終容積為200μl含3×105DCs的RPMI從小鼠右脅腹經(jīng)皮下注射，對側(cè)脅腹皮下注射PancO2(1×106于200μlRPMI)，以使小鼠受到腫瘤威脅。治療性接種在腫瘤形成可觸性結(jié)節(jié)后開始進行。吉西他濱以25或50mg每公斤體重腹腔內(nèi)給藥，每周2次。腫瘤生長以直徑的乘積表示。當(dāng)腫瘤的大小超過400mm2或觀察到動物的窘迫征象在48h內(nèi)加倍時動物將被處死。為了原位腫瘤更好發(fā)展，在麻醉狀態(tài)下切開小鼠的左脅腹，移除脾臟以接納胰腺?？偭窟_2×105PancO2細胞被注射入胰腺。通過LaThetaTM型小型動物體內(nèi)CT掃描儀(Zinsser Analytic)來監(jiān)測腫瘤的生長。動物CT掃描是在Heinz-Peter Scheuber教授(TierschutzInformationsZentrum for生物醫(yī)學(xué)研究所，慕尼黑大學(xué))與Adam Glowalla(Zinsser Analytic，德國)的協(xié)助下進行的。

1.9 體內(nèi)細胞毒性檢測

檢測通過將羧基熒光素雙乙酸-琥珀酰亞胺酯(CFSEhigh，2μM；CFSElow， 0.2μM)標(biāo)記的C57BL/6淋巴細胞導(dǎo)入接種了或未進行接種的小鼠來進行。CFSEhigh標(biāo)記的細胞由p15E肽(2μg/ml)來刺激，而CFSElow標(biāo)記的細胞則未被刺激。靶細胞注入20h后，將CFSEhigh及CFSElow標(biāo)記的細胞以1:1的比例經(jīng)腹腔注入，移除脾臟，CFSEhigh與CFSElow細胞的比值由流式細胞術(shù)決定。細胞毒性通過以下公式計算：接種小鼠：CFSEhigh/CFSElow；未接種小鼠：CFSEhigh/CFSElow。

圖1 骨髓源性DCs能夠攝取腫瘤抗原，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70。DCs來源于與粒-巨細胞集落刺激因子和IL-4共同培養(yǎng)的C57BL/6小鼠骨髓。在培養(yǎng)的第6天，將DCs與經(jīng)紫外線照射的CFSE標(biāo)記的PancO2細胞以10:1的比例共同孵育。CD11c+DCs對腫瘤細胞的攝取通過FACS分析測定(A所示為5組FACS分析中有代表性的一組結(jié)果)。在培養(yǎng)的第6天，用不同的刺激來激發(fā)DCs，持續(xù)24h。用ELISA分析所獲上清液中IL-12的產(chǎn)量。[B所示數(shù)據(jù)為兩次獨立實驗的平均值(SEM)]

1.10 體外細胞毒性測定

我們在慕尼黑大學(xué)免疫學(xué)系的R Wank教授的協(xié)助下進行了51鉻釋放檢測。首先在37℃的環(huán)境中，將靶細胞在Na251CrO4(100μCi/106靶細胞)溶液中孵育1h，然后將細胞沖洗3遍，再與效應(yīng)細胞共同培養(yǎng)于96孔圓底培養(yǎng)板上(5×103/孔)，總體積為200μl。在37℃的環(huán)境中孵育4h后，獲得50μl上清液，應(yīng)用伽馬計數(shù)器(Wallac Oy，土爾庫，芬蘭)檢測其放射性。通過以2.5%的最終濃度與曲通X-100絡(luò)合體系(Sigma，慕尼黑，德國)共同培養(yǎng)來評估最大釋放量。在不存在效應(yīng)細胞的情況下測定自發(fā)性釋放量。根據(jù)以下公式計算特異性殺傷性：特異性51Cr釋放=[(實驗計數(shù)-自發(fā)性計數(shù))/(最大計數(shù)-自發(fā)計數(shù))]×100%。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用司徒登氏t測驗來顯示在腫瘤防護上的顯著差異。我們比較了對照組動物及所有經(jīng)過處理的動物(包括無腫瘤及腫瘤陽性的動物)的腫瘤大小。–應(yīng)用Cox比例風(fēng)險模型分析Kaplan-Meier生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可抑制皮下腫瘤的發(fā)展

圖2 預(yù)防性接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗可全面阻止皮下PancO2腫瘤的發(fā)展。年齡為6～10周的雌性C57BL/6小鼠分別作如下處理：皮下接種PancO2激發(fā)的同系DCs(3×105)，或未被激發(fā)的同系DCs(3×105)，或經(jīng)紫外線照射的PancO2細胞(1×105)，以上均為每隔一周注射3次，或不作處理。最后一次接種后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2細胞皮下注射。定期檢測腫瘤的生長，腫瘤大小以直徑之積來檢測(A所示數(shù)據(jù)未每組中3只動物的平均值(SEM))。在平行實驗中，各組小鼠均在兩次接種后被處死，淋巴細胞的體外INFγ產(chǎn)量通過ELISA來檢測[B所示數(shù)據(jù)未每組中兩只動物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

我們前期曾提出經(jīng)紫外線照射而凋亡的腫瘤細胞激發(fā)的DCs在啟動抗人胰腺癌細胞CTLs方面優(yōu)于腫瘤溶解產(chǎn)物激發(fā)的DC[33]，此發(fā)現(xiàn)近期已在PancO2腫瘤模型中被證實[34]。因此，我們選擇經(jīng)紫外線照射的PancO2細胞作為腫瘤抗原的來源。骨髓源性DCs能夠攝取死亡的PancO2細胞，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70(圖1)。經(jīng)三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗接種可完全阻止小鼠腫瘤的發(fā)展(圖2A)。未經(jīng)處理的小鼠的腫瘤可在35天之內(nèi)發(fā)展至平均大小為110mm2(圖2B)。只有僅接受經(jīng)紫外線照射的PancO2細胞或接受未負載的DCs的小鼠的腫瘤會中度縮小(即35天后腫瘤平均大小約為44mm2)。接種了PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠的腫瘤防護與經(jīng)兩次接種后孤立淋巴細胞高水平分泌IFNγ有關(guān)(圖2B)。

圖3 預(yù)防性接種PancO2激發(fā)的DCs誘導(dǎo)與長期腫瘤防護相關(guān)的免疫記憶。年齡為6～10周的雌性C57BL/6小鼠分別作如下處理：皮下接種PancO2激發(fā)的同系DCs(3×105)，或未被激發(fā)的同系DCs(3×105)，或經(jīng)紫外線照射的PancO2細胞(1×105)，以上均為每隔一周注射3次，或不作處理。最后一次接種后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2細胞皮下注射。定期檢測腫瘤的生長，腫瘤大小以直徑之積來檢測。接受DC瘤苗接種的小鼠仍保持無瘤狀態(tài)，并在初始腫瘤接種后的第95天再次皮下注射1×106PancO2腫瘤細胞。事先未經(jīng)處理的小鼠充當(dāng)對照組[圖所示數(shù)據(jù)未每組中3只動物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

2.2 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可建立免疫記憶及長期腫瘤防護

受到PancO2細胞威脅的對照組動物在40～50天后死亡，而預(yù)防性接種了PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠可無瘤生存3個月以上。這些小鼠在第一次腫瘤威脅95天后再次受到PancO2細胞的攻擊。如圖3所示，相較于對照組迅速長大的腫瘤(第26天腫瘤平均大小為91mm2)，接種瘤苗的小鼠仍然可以抵抗腫瘤發(fā)展。接種瘤苗的小鼠在第95天再次受到PancO2攻擊，但仍可長期存活且數(shù)月后仍沒有局部或系統(tǒng)性腫瘤生長，最終對其施以安樂死。

2.3 接種經(jīng)PancO2激發(fā)的DCs可誘導(dǎo)腫瘤特異性CTLs

盡管小鼠腫瘤的發(fā)展可以對抗，DC瘤苗接種誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)仍有待于證實。病毒相關(guān)性的小鼠白血病病毒(MuLV)env-蛋白由gp70基因編碼并由小鼠癌細胞選擇性表達。圖4A表明gp70 mRNA表達于來源于Balb/C小鼠的PancO2及C26結(jié)腸癌細胞，但不表達于正常組織。將負載MuLV env-蛋白源性p15E肽的來源于Balb/C小鼠的CFSEhigh標(biāo)記的淋巴細胞及CFSElow標(biāo)記的、未負載的淋巴細胞注入接種了三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗或未作處理的小鼠的尾靜脈。相較于未處理的動物，通過使接種過的動物的p12E負載的CFSEhigh淋巴細胞達標(biāo)，可算得約12%的特異性殺傷率(圖4B)。因此，PancO2負載的DCs不僅可對抗腫瘤發(fā)展，還能夠誘導(dǎo)免疫記憶及腫瘤特異性CTL反應(yīng)。

圖4 接種PancO2激發(fā)的DCs可誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。H2-kb-限制性肽p15E來源于病毒相關(guān)的gp70基因所編碼的小鼠白血病env蛋白。gp70 mRNA的表達可在PancO2細胞、C26克隆癌細胞(來源于Balb/c小鼠品系)以及C57BL/6小鼠的肝臟、脾臟、胰腺及淋巴結(jié)的標(biāo)本中檢測到(A)。為了檢測體內(nèi)p15E特異性CTLs，將負載p15E肽的來源于Balb/C小鼠的CFSEhigh標(biāo)記的淋巴細胞及CFSElow標(biāo)記的、未負載的淋巴細胞注入接種了三次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗或未作處理的小鼠的尾靜脈。20小時后，移除脾臟，通過流式細胞術(shù)檢測不同標(biāo)記的淋巴細胞的頻度。通過使接種過的動物的p12E負載的CFSEhigh淋巴細胞相較于未經(jīng)處理動物的相對減少量達標(biāo)來檢測特異性殺傷(B所示數(shù)據(jù)未4個獨立實驗的平均值(SEM))。

2.4 腫瘤特異性CTLs可識別并殺傷PancO2細胞

與人類胰腺癌相似，PancO2源性腫瘤是弱免疫原性的。而且，PancO2細胞僅低水平表達經(jīng)典CTL介導(dǎo)的殺傷所需的MHCⅠ(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們在將PancO2細胞應(yīng)用于體內(nèi)治療性接種模型前先分析了其在體外能否被抗原特異性CTLs識別。我們應(yīng)用了特異性針對OVA表位SIINFEKL的來源于轉(zhuǎn)基因OT-1動物的CTLs[35,36]。在51Cr釋放檢驗中，負載SIINFEKL肽或者不相關(guān)對照肽的PancO2細胞與來源于野生型小鼠或OT-1小鼠的淋巴細胞共同培養(yǎng)。負載SIINFEKL肽或者不相關(guān)肽的EL4細胞被用作對照目標(biāo)。負載SIINFEKL的PancO2細胞可被轉(zhuǎn)基因OT-1小鼠源性淋巴細胞特異性殺傷(見圖5)。

2.5 DC瘤苗接種聯(lián)合吉西他濱可提高PancO2胰腺癌模型的生存率

圖5 PancO2細胞可被抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞以MHCⅠ限制性的方式識別并殺傷。在51Cr釋放檢驗中，負載SIINFEKL肽或者不相關(guān)對照肽的PancO2細胞與來源于野生型C57B/6小鼠或OT-1小鼠的淋巴細胞共同培養(yǎng)，效應(yīng)子與目標(biāo)子的比值從3.125:1到100:1，負載SIINFEKL肽或者不相關(guān)肽的EL4細胞與來源于轉(zhuǎn)基因OT-1小鼠的淋巴細胞共同培養(yǎng)，被用作陽性對照。

注入PancO2細胞后的第14天，我們建立了4個腫瘤大小相當(dāng)(約13mm2)的實驗組。對各組小鼠分別進行如下處理：不作處理(對照)，PancO2激發(fā)的DCs(DC)，吉西他濱(Gem)和PancO2激發(fā)的DCs加吉西他濱(DC+Gem)。吉西他濱每周給2次藥，50mg/kg，在聯(lián)合治療方案中，則分別在接種DCs前后兩天給藥。治療共持續(xù)5周。如圖6A所示，治療開始后第58天，對照組動物已全部死亡，單獨DC瘤苗接種與吉西他濱治療在預(yù)防死亡方面效果相當(dāng)(治療第58天生存率分別為14%和17%；DC接種對對照組和吉西他濱對對照組P分別為0.13和0.08)。與每種治療策略單獨應(yīng)用相比，聯(lián)合治療方案可使生存率顯著提高(治療第58天生存率為50%；聯(lián)合治療對對照組P＜0.005)。在所有治療組中局部腫瘤生長均受到抑制，在治療開始后第32天時，對照組、DC接種組、吉西他濱組及聯(lián)合治療組的腫瘤平均大小分別為：123mm2、91mm2、85mm2和67mm2。但是，在于對照組比較時，這些結(jié)果均未達到統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6B)。DC瘤苗接種加吉西他濱治療使動物生存率升高不僅僅是相加效應(yīng)，而且吉西他濱單獨治療不足以顯著提高生存率或抑制局部腫瘤生長，因此，我們推測吉西他濱治療與DC瘤苗接種之間存在著獨立于藥物直接的細胞毒性效應(yīng)之外的協(xié)同作用。為了驗證此假設(shè)，我們將吉西他濱劑量減半并重復(fù)了該實驗。如圖7所示，劑量為50mg/kg和25mg/kg的吉西他濱聯(lián)合DC瘤苗接種均可提高帶PancO2腫瘤小鼠的生存率(DC+吉西他濱50mg/kg對對照組P=0.01；DC+吉西他濱25mg/kg對對照組P=0.001)。如前，兩種治療策略單獨應(yīng)用均不足以顯著提高生存率(DC瘤苗接種單獨治療對對照組P=0.98；吉西他濱單獨治療對對照組P=0.18)。

圖6 DC瘤苗接種聯(lián)合吉西他濱治療可提高皮下PancO2小鼠胰腺癌模型的生存率。將0.5×106PancO2細胞經(jīng)皮下注射入年齡為6到10周的雌性C57BL/6小鼠體內(nèi)。在腫瘤接種后的第14天，我們建立了4個實驗組。對各組小鼠分別進行如下處理：不作處理(n=5；對照)，隔周接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗(n=7；DC)，每周兩次腹腔內(nèi)注射吉西他濱(50mg/kg體重)(n=6；Gem)以及PancO2激發(fā)的DCs聯(lián)合吉西他濱(n=6；DC+Gem)。治療共持續(xù)5周。以Kaplan-Meier圖表來描述各組的生存率(A)。定期檢測腫瘤的生長，腫瘤大小以直徑之積來檢測(B)。圖所示數(shù)據(jù)為各組動物相關(guān)數(shù)據(jù)的平均值(SEM)。

2.6 接種PancO2激發(fā)的DCs瘤苗可預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移及原位生長

對未經(jīng)處理或已接種3次PancO2激發(fā)的DCs瘤苗的小鼠，于末次接種后的第7天，經(jīng)尾靜脈注入25×104PancO2細胞。如圖8A所示，未經(jīng)處理的小鼠60天內(nèi)全部死亡，相反，此模型中PancO2激發(fā)的DCs瘤苗防止了死亡發(fā)生。組織病理學(xué)分析證實了未經(jīng)處理的小鼠肺內(nèi)存在腫瘤細胞(圖8B)。我們在一個原位腫瘤模型中檢測了DC瘤苗接種抑制局部腫瘤生長的能力。一組小鼠不作處理，另一組小鼠經(jīng)皮下接種3×105負載PancO2的DCs。最后一次接種后的第7天，如材料及方法部分所述，將2×105PancO2細胞注射入胰腺。誘瘤后的第19天，切除肉眼可見的腫瘤并對其進行評估。對照組中，腫瘤體積約達400mm2，平均重量為400mg(圖9，左)；而預(yù)防性接種PancO2負載的DCs完全阻止了原位PancO2腫瘤的生長(DC接種對對照組P=0.014)。一臺試驗用小型動物CT掃描儀被用來監(jiān)測一些動物體內(nèi)腫瘤的生長。胰腺內(nèi)注射PancO2細胞3周后，未經(jīng)處理的動物的腫瘤直徑約達1cm(圖9；右側(cè)，上方)。

3 討論

本實驗中我們首次證實了DC瘤苗接種可聯(lián)合吉西他濱來提高胰腺癌小鼠模型的生存率，此外，我們還證實了預(yù)防性接種DC瘤苗可預(yù)防小鼠PancO2胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和原位生長。我們選擇PancO2小鼠腫瘤模型因為其弱免疫原性是類似于人類胰腺癌的典型特征之一[37]。然而，盡管MHCⅠ低水平表達，PancO2細胞仍可被CTLs識別并殺傷，而且免疫治療方法在此模型中行之有效[27,28]。首先，我們證實了PancO2誘發(fā)的DCs可建立與長期腫瘤防護有關(guān)的免疫記憶并能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)。值得注意的是，具有體內(nèi)細胞溶解能力的肽特異性CTLs負載于多克隆全細胞抗原制劑的DCs誘導(dǎo)。腫瘤的CTLs浸潤有利于胰腺癌及其他實體癌的預(yù)后[7,39]。我們尚無法通過組織病理學(xué)檢測DC瘤苗接種后T細胞浸潤的增加，同時在治療性皮下模型上腫瘤大小縮小并不顯著。然而，我們的數(shù)據(jù)顯示DC瘤苗接種可以預(yù)防腫瘤經(jīng)血液播散所致的死亡以及抑制肺轉(zhuǎn)移的形成。這與在B16小鼠黑色素瘤模型上的發(fā)現(xiàn)相一致：盡管瘤苗接種治療無法阻止B16小鼠黑色素瘤的局部生長，但其在抗肺轉(zhuǎn)移性疾病方面仍然有效[30,40]。

圖9 預(yù)防性接種負載PancO2的DCs瘤苗可阻止原位腫瘤的生長。一組小鼠不作處理，另一組小鼠經(jīng)皮下接種3×105負載PancO2的DCs。最后一次接種后的第7天，開腹切除脾臟并將2×105PancO2細胞注射入胰腺。手術(shù)后的第19天，切除腫瘤并稱重(左，數(shù)據(jù)為各組的平均值(SEM))。用CT掃描來監(jiān)測一些動物體內(nèi)原位腫瘤的生長。胰腺內(nèi)注射PancO2細胞19天后未經(jīng)處理的對照動物(右，上)及接種瘤苗動物(右，下)的典型腹部CT掃描如圖所示。

盡管全部負載異位PancO2腫瘤的小鼠最終均死于該病，但其中一些仍在負載著相當(dāng)大的皮下腫瘤的情況下生存了很長時間。相反的，負載原位腫瘤的小鼠則在腹腔轉(zhuǎn)移形成后迅速死于消耗綜合征。重要的是，預(yù)防性皮下DC瘤苗接種完全阻止了原位腫瘤的生長。所以，DC瘤苗接種誘導(dǎo)的系統(tǒng)免疫反應(yīng)能夠抑制腹腔內(nèi)腫瘤生長。盡管Takigawa等人之前在胰腺癌倉鼠模型上已證實腹腔內(nèi)注射腫瘤溶解產(chǎn)物激發(fā)的DCs可以抑制原位腫瘤的腹腔內(nèi)播散[41]，這仍是一個重要的新發(fā)現(xiàn)。盡管尚未被正式地驗證，但似乎DC瘤苗接種所誘導(dǎo)的循環(huán)的腫瘤特異性CTLs能夠進入腹腔，從而識別并殺死腫瘤細胞。因此，輔助性DC瘤苗接種對于預(yù)防胰腺癌病人胰腺十二指腸切除術(shù)后浸潤的或局部殘留的腫瘤細胞所致的腫瘤復(fù)發(fā)可能有效。盡管DC瘤苗接種與吉西他濱在治療組效果相當(dāng)，但二者均既不能阻止已建立的腫瘤的進展，也不能顯著降低死亡率。眾所周知，PancO2細胞對化療相對耐藥，而瘤苗接種無效則可能由于腫瘤所致的免疫抑制環(huán)境(如，對T細胞介導(dǎo)的免疫不利的可溶性因子如IL-10或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β的分泌)，效應(yīng)細胞接觸腫瘤組織受限或者腫瘤浸潤的淋巴細胞失活，這也是其另一個與人類胰腺癌相似的特征[7,42]。如果聯(lián)合DC瘤苗接種和吉西他濱，帶瘤小鼠的生存率會顯著提高。這與之前發(fā)現(xiàn)的吉西他濱可提高體內(nèi)CD40配基化所激發(fā)的免疫的效果[24]相一致。在我們的模型上吉西他濱提高DC瘤苗接種效果的確切機制尚不清楚。在一個人類體外模型中，我們證實了藥物可以增加胰腺癌細胞對CTL反應(yīng)的敏感性[25]。其他人已證實吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡可增加腫瘤內(nèi)DCs向CTLs交叉遞呈腫瘤抗原[24]?；熕碌拿庖咭种瓶赡軙拗破渑c腫瘤的免疫治療方法的聯(lián)合。盡管有報道稱在動物模型中吉西他濱可抑制B細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[43]，但它仍可用于胰腺癌患者而不會導(dǎo)致T細胞和DC功能的相關(guān)缺失[22]。此外，初步數(shù)據(jù)顯示吉西他濱甚至可以抑制Th2及特異性擴大癌癥患者體內(nèi)的Th1型免疫反應(yīng)[22]。吉西他濱在局部腫瘤環(huán)境上的治療效果以及腫瘤抗原特異性的CTLs的頻率和作用目前仍在研究中。

盡管臨床試驗已證實DC瘤苗接種可規(guī)律性的建立腫瘤特異性免疫，但顯然消化道惡性腫瘤患者對免疫治療的臨床反應(yīng)卻微乎其微[12]。目前，研究人員正在試圖找尋有助于克服腫瘤免疫抑制且不干擾腫瘤直接免疫反應(yīng)激活的策略。越來越多的證據(jù)提示已經(jīng)較成熟的治療策略如放療、外科縮瘤術(shù)及化療可以成功地聯(lián)合免疫治療的方法[44-46]。吉西他濱目前用于治療不可切除的胰腺癌且不會導(dǎo)致免疫抑制。本實驗中，我們在胰腺癌小鼠模型上證實了聯(lián)合吉西他濱可擴大DC瘤苗接種的療效?；诖税l(fā)現(xiàn)，我們機構(gòu)啟動了研究吉西他濱聯(lián)合自體DC瘤苗治療晚期胰腺癌的Ⅱ期試驗。

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