河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院科研中心 周凱旋 艾軍 單保恩

一直以來，傳統(tǒng)的腫瘤研究理論把腫瘤看作為一個均一的細胞團體，并認為腫瘤生長是所有腫瘤細胞共同增殖的結(jié)果。治療癌癥的傳統(tǒng)方法則是通過手術(shù)切除、放化療或生物治療等方法盡量去除已經(jīng)存在的腫瘤細胞，但在常規(guī)治療后癌癥的復發(fā)與轉(zhuǎn)移仍是現(xiàn)今需要面對的嚴峻問題，使得傳統(tǒng)的腫瘤研究思路似乎也進入到了一個發(fā)展平臺期。

近年來的許多研究表明，腫瘤是一個異質(zhì)性的組織，其生長是由于組織內(nèi)一小部分具有干細胞性質(zhì)的腫瘤細胞增殖分化的結(jié)果。這部分細胞具有引起腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質(zhì)性、甚至具有轉(zhuǎn)移與耐藥的能力，并由此提出了“腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells，CSC)假說”。如果傳統(tǒng)治療忽略了這部分細胞，即使其他大部分腫瘤細胞都被消滅，但腫瘤仍然會面臨著復發(fā)的可能。而近年來，隨著腫瘤干細胞假說的提出，以及腫瘤干細胞研究的發(fā)現(xiàn)與興起，使得腫瘤研究進入了一個新的生命時期。目前，已經(jīng)在白血病、乳腺癌、腦癌等腫瘤組織中成功分離出了腫瘤干細胞，深入了解這些腫瘤干細胞的生物學特性、發(fā)展相應(yīng)的鑒別方法以及特殊的治療手段對腫瘤研究領(lǐng)域與癌癥的臨床治療都有著極其重要的意義。

1 腫瘤干細胞的認知之路

腫瘤干細胞的證據(jù)可以追溯到十九世紀70年代，早在1875年，病理學家Cohnheim在用顯微鏡對腫瘤組織和胚胎組織進行觀察和比較時，發(fā)現(xiàn)兩者很相似，因而認為，腫瘤可能來源于位置錯誤的殘余胚胎樣細胞。到上個世紀初，學者Rotter通過研究認為，在胚胎形成期的原始性細胞游走至成熟性腺組織以外并突發(fā)性地存留下來，有可能在日后形成腫瘤”。1956年，Makino等分析了大鼠腹水中腫瘤細胞的染色體，發(fā)現(xiàn)這些高度變異的染色體有可能來自同一個克隆。

人們真正對腫瘤干細胞進行深入研究開始于二十世紀60年代，1963年，Bruce和Van Der Gaag實驗證明脾臟克隆形成技術(shù)可以用來定量檢測淋巴瘤細胞的增殖能力。Kleinsmith和Pierce研究發(fā)現(xiàn)僅僅單獨一個胚胎腫瘤細胞產(chǎn)生的后代包含了14種不同的組織類型，這暗示畸胎瘤起源于一個多能的惡性干細胞。其后，Wodinsky等發(fā)現(xiàn)將淋巴細胞白血病L1210細胞移植到體內(nèi)，脾臟克隆形成率只有1%～3%。Park和他的同事將小鼠腹水中獲得的不同種骨髓瘤細胞體外克隆培養(yǎng)，僅有0.01%～1%的腫瘤細胞可以形成克隆集落，與體內(nèi)進行的脾臟克隆形成實驗得到的克隆形成率相一致。1975年，Cairns闡述了三種在自然條件下能延緩組織干細胞發(fā)生突變的可能存在的機制，并且提示如果存在一個早期突變將會更加有利于克隆形成過程中的變異。Sell和Pierce[1]在分析前人研究成果之后，認為腫瘤細胞也和正常組織細胞一樣存在分化、成熟，如果阻斷腫瘤干細胞的分化將會影響腫瘤細胞的增殖并有利于控制腫瘤的生長和惡化。1997年，Blair[2]等與Bonnet[3]及其同事分別報道了在急性骨髓性白血病中只有很少的一部分細胞(0.02%～1%)能夠在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成新的腫瘤。

在前人研究的基礎(chǔ)上，Reya等[4]于2001年提出了“腫瘤干細胞假說”，該假說認為腫瘤組織是由異質(zhì)性的細胞群體組成，腫瘤組織中存在的一小部分具有干細胞性質(zhì)的腫瘤干細胞具有無限的自我更新能力，可以產(chǎn)生與上一代完全相同的子代細胞，并且具有多種分化潛能和高度增殖能力，產(chǎn)生不同表型的腫瘤細胞，并使腫瘤在體內(nèi)不斷擴大，或形成新的腫瘤。

2002年，Clarke的研究小組[5]利用熒光活化細胞分離技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)即流式細胞術(shù)首次從乳腺癌腫分離出腫瘤干細胞。2003年Al-Hajj等[6]通過特異性的細胞表面標志Lin-ESA+CD44+CD24-/low分離純化出乳腺癌干細胞，這種干細胞只占有乳腺癌細胞的2%，但只需要200左右個細胞就可在小鼠乳腺中形成腫瘤。此后，研究人員又用不同的細胞表面分選標記分別從腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、肉瘤[8]、結(jié)腸癌[9-11]、頭頸癌[12,13]、肝癌[14-16]、肺癌[17]、黑素瘤[18]、胰腺癌[19]、前列腺癌[20]中分離出腫瘤干細胞，這些研究進一步支持了腫瘤干細胞假說，也為開拓新一代腫瘤治療方案提供了依據(jù)。

2 腫瘤干細胞的起源

關(guān)于腫瘤的起源，目前有兩種學說：一是正常干細胞經(jīng)過突變形成腫瘤干細胞，進而發(fā)展成為腫瘤；二是一部分組織內(nèi)細胞在去分化后變?yōu)橛字杉毎⒕哂蟹至涯芰Α煞N觀點都持有各自的實驗證據(jù)，但目前腫瘤的干細胞起源學說得到越來越多的研究結(jié)果支持。

關(guān)于腫瘤干細胞的起源，Reya[4]通過比較造血干細胞和白血病干細胞的特點，發(fā)現(xiàn)它們之間有很多相似之處：① 都有自我更新和增殖分化的能力；②存在相似的調(diào)節(jié)自我更新的信號通路，比如Bmi-1、Wnt、Shh和Notch等[21-23]；③可以分化成各種不同表型的細胞。因此，認為腫瘤干細胞很可能是起源于正常的干細胞，因為從干細胞突變成腫瘤干細胞要比從已經(jīng)分化的細胞重編程為具有自我更新能力的細胞要來得簡單的多。而且另外一個理由是，腫瘤的產(chǎn)生是多基因突變作用的結(jié)果，由于干細胞具有自我更新能力，且生存周期較長，因此，干細胞發(fā)生多次突變的機會遠比成熟的終末分化細胞高。在長期的生存過程中，干細胞最有可能累積多種基因突變，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)變成腫瘤干細胞。

除了正常的干細胞可以作為腫瘤干細胞的來源之外，定向祖細胞也可以作為腫瘤干細胞的來源之一。近年來的一些研究[24-27]支持了這種推測，他們的研究表明由于基因易位而產(chǎn)生的一些融合蛋白可以將白血病干細胞的特征傳遞給定向造血祖細胞，并且通過用基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，白血病干細胞的基因表達譜和定向祖細胞的基本一致，只有少數(shù)本來只在造血干細胞中表達而在定向祖細胞中不表達的基因，在白血病干細胞中又重新被激活，而這些大部分都是調(diào)控細胞自我更新能力的基因。

3 腫瘤干細胞與腫瘤

3.1 白血病

腫瘤干細胞生物學特征在造血系統(tǒng)中研究的最早也最深入。大部分腫瘤干細胞的知識也都是通過研究造血干細胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)和白血病干細胞(Leukemia Stem Cells，LSCs)而獲得的。在二十世紀80年代末90年代初的時候，人們對細胞表面標記譜的了解加深，并將其與流式細胞術(shù)結(jié)合起來，使得快速分離純化干細胞成為可能，這極大地推動了腫瘤干細胞的研究，為腫瘤干細胞的存在提供了更直接的證據(jù)[28]。

Dick等[3]利用FACS從急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)中首次分離出腫瘤干細胞。他們發(fā)現(xiàn)在AML細胞中，只有表型為CD34+、CD38-的AML細胞才能在NOD/SCID(Non-obese Diabetic，Severe-Combined Immunodeficient)小鼠中產(chǎn)生類似人類的急性粒細胞白血病，而表型為CD34+、CD38+和CD34-的AML細胞在NOD/SCID小鼠中都不能誘導產(chǎn)生白血病。另外，這種通過異源移植腫瘤細胞產(chǎn)生的AML可以繼續(xù)移植到新的小鼠體內(nèi)而誘導產(chǎn)生新的AML，這也從另一個方面說明CD34+、CD38-表型的AML細胞具有自我更新的能力。有趣的是，白血病干細胞LSCs的CD34+、CD38-表型和造血干細胞HSCs的表型一樣，因此，認為LSCs有可能來源于HSCs。近年來Krivtsov和Twomey等[24]的研究工作也支持了這種假設(shè)，他們通過比較LSCs和粒-巨祖細胞(Granulocyte Macrophage Progenitors，GMPs)的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)兩者之間的基因表達譜絕大部分都相似，而只有少數(shù)與干細胞或者自我更新相關(guān)的基因被重新激活。并且他們還認為從GMPs轉(zhuǎn)變成LSCs可能是由MLL-AF9融合蛋白引起的，他們通過在GMPs中表達MLL-AF9融合蛋白，然后將這些GMPs注入到亞致死劑量照射的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠在這些小鼠體內(nèi)產(chǎn)生AML，并且只需要4個產(chǎn)生出的LSCs就可以在受體小鼠中產(chǎn)生新的AML。

此外，Cox等[29]用急性淋巴母細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)標本研究，發(fā)現(xiàn)只有CD34+、CD19-或者CD34+、CD10-表型的細胞才能在動物模型中形成腫瘤，同樣提示了急性淋巴母細胞白血病細胞可能來源于造血干細胞。

3.2 乳腺癌

乳腺癌組織是由異質(zhì)性的乳腺癌細胞群體組成，其各型細胞的表面分子標記不同，這些表面分子標記分別包括CD44、CD24、B38.1及ESA(Epithelial Specific Antigen)，CD24和CD44是黏附分子，而B38.1則被認為是乳腺癌和卵巢癌的特異性標記。Al-Hajj等[6]利用流式細胞儀首次將各種表型的乳腺癌細胞分離出來，然后把這些細胞以2、5、8×105的量注入到NOD/SCID小鼠乳房脂肪墊中致瘤，發(fā)現(xiàn)所有的CD44+、B38.1+、CD24-在12周內(nèi)都形成腫瘤。而注入表型為CD44-、B38.1-、CD24+癌細胞的小鼠都沒有長瘤。接著將CD44+、CD24-/low Lineage-細胞和其他Lineage-表型的細胞注入到小鼠乳房脂肪墊中，發(fā)現(xiàn)5×104個細胞能長出腫瘤，而當細胞移植量為104個時卻只有很少的一部分能長出腫瘤。另外，注入103個表型為CD44+、CD24-/low Lineage-細胞在小鼠體內(nèi)致瘤率為100%。其后進一步研究發(fā)現(xiàn)，將CD44+、CD24-/low Lineage-細胞在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳四代，其仍舊具有強致瘤性，并且這種表型的細胞可以分化產(chǎn)生其他表型的腫瘤細胞。CD44+、CD24-/low Lineage-乳腺癌細胞這種特性和干細胞的性質(zhì)極為相似，故可以認為CD44+、CD24-/low Lineage-乳腺癌細胞為乳腺癌干細胞。

3.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤

Singh[30]等在2003年從人原發(fā)性腦瘤的不同亞型的腫瘤細胞中分離純化出腦腫瘤干細胞(Brain Tumor Stem Cells，BTSCs)，并且這些細胞有顯著的增殖、分化和自我更新能力。他們分離的這種細胞亞型表達細胞表面標記CD133，并且這種CD133+細胞只占有全部腫瘤細胞中極少的一部分。CD133+細胞不表達分化的神經(jīng)細胞表面標志，CD133+細胞在體外能分化成其他亞型的腫瘤細胞，且這些腫瘤細胞的表型和體內(nèi)腫瘤細胞的表型相一致。BTSCs在一定程度上和正常的神經(jīng)干細胞很相似，它們具有同樣的表型，都表達CD133和Nestin，并且從不同病人腦瘤中分離出的BTSCs都具有相同的表型，這暗示了BTSCs可能來源于正常神經(jīng)干細胞。目前為止，很多不同的研究小組已經(jīng)將從臨床上不同級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的BTSCs分離鑒定出來[31-33]。

對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的研究已能足夠確定BTSCs的存在，但是，確切地說，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞研究還有一定的局限性。一個腫瘤干細胞不僅僅能誘發(fā)腫瘤，更重要的是，它需要具有產(chǎn)生和分化出與原始腫瘤具有一樣表型的腫瘤的能力。當然這樣的研究需要將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞移植到免疫缺陷小鼠的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域，這個在技術(shù)上本身就具有很大的挑戰(zhàn)性。除此之外，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的研究也還存在其他的限制因素[34]。

3.4 結(jié)腸癌

Dalerba等[10]和Ricci-Vitiani等[11]在2007年同時報道他們已經(jīng)成功地分離并鑒定了富含結(jié)腸癌干細胞的CD133+表型結(jié)腸癌細胞亞群。O'Brien研究發(fā)現(xiàn)所有的結(jié)腸癌起始細胞(Colon Cancer-Initiating Cells，CC-ICs)都是CD133+表型的，有限稀釋分析試驗表明5.7×104個未分選的腫瘤細胞中含有一個CC-IC，而在262個CD133+腫瘤細胞中就含有一個CC-IC，說明CD133+結(jié)腸癌細胞中富含CC-ICs量為未分選的腫瘤細胞的200倍。通過連續(xù)的小鼠致瘤試驗證明CC-ICs具有自我更新能力，并且能分化成其他類型的腫瘤細胞。Ricci-Vitiani等在用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD133+結(jié)腸腫瘤細胞時，發(fā)現(xiàn)其在體外能以未分化的腫瘤球的形式迅速增殖生長并持續(xù)一年以上，并且移植后產(chǎn)生的腫瘤與原始腫瘤表型相同。

而Dalerba等[9]則認為結(jié)腸癌干細胞的表型應(yīng)該是EpCAMhigh/CD44+，因為在有的腫瘤中可能不表達CD133分子，但卻可以表達CD44表面分子，這說明細胞表面標志為EpCAMhigh/CD44+的結(jié)腸癌細胞中富含的結(jié)腸癌干細胞要比CD133+表型的更加全面，并且EpCAMhigh/CD44+表型的細胞也可以用CD133表面標志來分選CD133+細胞亞群。另外他們認為CD166也可以用來進一步分選出結(jié)腸癌干細胞。

3.5 肝癌

Suetsugu等[15]首次在肝癌細胞系Huh-7中分離出CD133+表型的細胞，通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)該亞型的細胞占有Huh-7細胞系總體的50.8%。RT-PCR結(jié)果表明，Huh-7中CD133+細胞的甲胎蛋白(AFP)mRNA表達水平明顯高于Huh-7中CD133-細胞的甲胎蛋白mRNA表達水平。在SCID小鼠成瘤試驗中，Huh-7的CD133-細胞不能使小鼠致瘤，而Huh-7的CD133+細胞能成功致瘤。Yin等[16]在研究肝癌細胞系SMMC-7721時，發(fā)現(xiàn)CD133+表型的細胞只占有細胞系總數(shù)的0.1%～1%。SMMC-7721中CD133+細胞具有很強的致瘤性，體外培養(yǎng)的時候，在軟瓊脂和Matrigel上具有較強的克隆形成能力。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)1000左右個CD133+SMMC-7721細胞足夠在NOD/SCID小鼠中成瘤，而CD133-表型的細胞則不具有致瘤的能力。另外，他們還發(fā)現(xiàn)CD133+細胞也同樣存在于原發(fā)肝細胞癌樣品中，以及肝硬化的組織中，正常肝組織中則不存在CD133+表型的細胞。這些研究表明肝細胞癌中的肝癌干細胞的表型有可能是CD133+，或者是CD133+肝癌細胞中的一個亞型。然而，由于肝癌的種類繁多，而且各種肝細胞的起源也不盡相同，以及肝細胞所具有的一些特殊性質(zhì)(比如，終末分化的肝細胞在肝臟損傷的情況下可以重新被激活分裂增殖能力)，是否各種肝癌干細胞都是同一個表型，還有待于更多的研究去論證。

3.6 前列腺癌

Collins等[20]從前列腺癌中分離出具有CD44+/α2β1high/CD133+表型的前列腺癌干細胞，這種細胞只約占腫瘤細胞的0.1%，具有很強的自我更新能力，并且可以產(chǎn)生其他各種具有分化標志的非致瘤癌細胞，比如能表達雄激素受體以及前列腺酸性磷酸酶。他們還從不同級別的前列腺癌中分離出CD44+/α2β1high/CD133+表型的腫瘤細胞，并發(fā)現(xiàn)這種前列腺癌干細胞與前列腺癌的級別無關(guān)。

3.7 其他腫瘤組織中的腫瘤干細胞

目前除了在上述的幾種腫瘤組織中分離出腫瘤干細胞之外，在其他腫瘤組織中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)、分離出富含腫瘤干細胞的細胞亞群。Gibbs等[8]從骨肉癌中分離出一小亞群腫瘤細胞，它們具有自我更新能力，并且在無血清的條件下能形成懸浮的細胞球，稱為“Sarcospheres”。這些骨肉瘤細胞能在基因水平表達STAT3以及多能胚胎干細胞的標志基因Oct3/4和Nanog，但從蛋白水平來檢測卻發(fā)現(xiàn)量很少。進一步研究發(fā)現(xiàn)，只有表達間充質(zhì)干細胞標志Stro-1、CD44和CD105的腫瘤細胞才能被誘導分化為其他表型的腫瘤細胞。這表明骨肉瘤干細胞的表型應(yīng)為Stro-1+/CD105+/CD44+。

Prince等[12]在對頭頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD44+表型的腫瘤細胞中存在一小部分細胞能在小鼠體內(nèi)實驗中生成新的腫瘤。進一步分析表明，具有致瘤能力的CD44+細胞能在RNA和蛋白水平表達Bmi1基因，而Bmi1基因在干細胞調(diào)控自我更新中起著重要作用，當然Bmi1 也和腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Chen等[13]將頭頸部鱗癌的發(fā)生與CD133/Src信號通路的調(diào)控及上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)具有致瘤能力的頭頸部鱗癌細胞亞群可隨著CD133上調(diào)與EMT效應(yīng)的增強而增多，進一步闡明了這種癌癥的發(fā)生機制。

Fang等[18]研究分析了黑色素瘤干細胞，他們發(fā)現(xiàn)在分析的樣品中，其中約有20%的黑色素瘤能在人胚胎干細胞培養(yǎng)基中生長，并且其中有一小部分細胞能形成懸浮的細胞球。而從黑色素瘤細胞球中分離出來的細胞在適當?shù)臈l件下能分化成多種種類的細胞，如黑色素細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等，這表明這種細胞又重新獲得了神經(jīng)嵴細胞的可塑性。在進行一系列連續(xù)的體外克隆試驗和體內(nèi)移植試驗中發(fā)現(xiàn)這種多潛能黑色素瘤球狀細胞依然能保持這種特性。進一步研究發(fā)現(xiàn)這些細胞都表達細胞表面分子CD20，即這些腫瘤發(fā)生細胞可以用CD20表面分子富集或者說黑色素瘤干細胞的表型為CD20+。

Li等[19]發(fā)現(xiàn)表型為CD44+/CD24+/ESA+的胰腺癌細胞在免疫缺陷的小鼠中具有高致瘤性，而這種表型的細胞只占全部胰腺癌細胞的0.2%～0.8%，有一半的小鼠在注射入100個CD44+/CD24+/ESA+表型的胰腺癌細胞都能成功致瘤，并且這種異源移植產(chǎn)生的腫瘤和人體原發(fā)性的胰腺癌在組織學上都沒有區(qū)別。CD44+/CD24+/ESA+表型的胰腺癌干細胞和正常干細胞一樣具有自我更新的能力，且這些細胞的發(fā)育信號分子Sonic Hedgehog表達有所增高。

肺癌中盡管暫時沒有分離出腫瘤干細胞，但動物實驗?zāi)Ｐ吞崾敬嬖诜伟└杉毎im等[17]在2005年利用細胞表面標志從大鼠細支氣管和肺泡管結(jié)合部位分離出表型為Sca-1+/CD45-/PECAM-/CD34+的支氣管肺泡干細胞(Bronchioalveolar Stem Cells，BASCs)。BASCs能在支氣管或者肺泡損傷時發(fā)生增殖。BASCs具有明顯的自我更新能力，并且是多潛能細胞。體外培養(yǎng)時或者肺癌細胞前體的K-ras基因的活化能使BASCs增殖。這些都表明BASCs有可能通過突變而產(chǎn)生腫瘤。具體的肺癌干細胞的鑒定和純化以及生物學性質(zhì)還有待于進一步的深入研究。

4 腫瘤干細胞的意義

4.1 腫瘤干細胞假說在臨床治療中的意義

腫瘤干細胞假說的提出對傳統(tǒng)的腫瘤治療手段發(fā)出了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的治療腫瘤的方法主要是通過手術(shù)切除、放化療等方法盡可能多的殺死腫瘤細胞，以減少腫瘤細胞數(shù)量來達到治療效果。然而，經(jīng)過臨床治療，大多數(shù)腫瘤患者一段時間之后又會復發(fā)腫瘤，這也是目前腫瘤生物學研究上一個很難解決的問題。而按照腫瘤干細胞假說來看待現(xiàn)在擁有的腫瘤治療方法，就能解釋為什么在腫瘤治療中很多治療方案都不理想。依靠傳統(tǒng)對待癌癥的治療模式，雖然消滅了大部分的癌細胞，但是如果占據(jù)總細胞數(shù)很小比例的腫瘤干細胞依然存在，即使其他大部分腫瘤細胞已被消滅，癌癥的復發(fā)依然會發(fā)生。因此，徹底地根除癌癥需要首先消滅腫瘤干細胞。

一些在白血病及實體瘤中的研究發(fā)現(xiàn)癌癥干細胞對目前癌癥常規(guī)的治療手段如化療、放療等都具有耐受性[35-37]，如腫瘤干細胞內(nèi)活性氧成份偏低，清除自由基的能力更強，成為腫瘤干細胞對輻射產(chǎn)生耐受的原因[38]。發(fā)展只針對腫瘤干細胞的藥物及治療方法對癌癥的臨床治療具有重要意義，最近，Gupta等[39]通過高通量篩選的方法從16000多種化合物中鑒定出了鹽霉素(Salinomycin)具有特異殺傷乳腺癌腫瘤干細胞的能力，其殺傷數(shù)量是普通抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel)的一百倍。在小鼠模型中還發(fā)現(xiàn)鹽霉素有抑制小鼠乳腺癌腫瘤生長以及減弱腫瘤細胞分化的作用。全基因表達譜分析表明鹽霉素會引起一些與乳腺癌腫瘤干細胞相關(guān)基因缺失的表達。但鹽霉素選擇性殺傷乳腺癌腫瘤干細胞的機制還不明了，有待進一步研究工作的進行。Shipitsin等[40]研究發(fā)現(xiàn)，遺傳基因的改變將會使一個正常的細胞忽視生長信號，最終產(chǎn)生腫瘤細胞將正常組織破壞。對腫瘤細胞的基因?qū)W研究也可以從其他方面解釋人類疾病和很多臨床上不能解釋的現(xiàn)象，所以對于腫瘤的基因治療也成為了一個新的研究方向。

盡管腫瘤干細胞假說很具有吸引力，但目前就腫瘤干細胞這個細胞群體在臨床上的重要性仍然不是十分清楚，它們在臨床上的行為可能很大程度上取決于該群體的數(shù)量與其生物學特征，而目前對這方面的研究還有待進一步完善[4]。隨著越來越多的證據(jù)表明腫瘤來源于腫瘤干細胞，很多腫瘤研究人員以及臨床研究人員都將研究重點放在腫瘤干細胞上，而不是整個腫瘤，這樣將能更快地發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的性質(zhì)和特點，對腫瘤臨床診斷與治療策略方面有著很大的指導作用，并為尋找新穎且有效的腫瘤治療方案奠定堅實的基礎(chǔ)。

4.2 腫瘤干細胞的分離與鑒定

目前分離腫瘤干細胞主要有3種方法。⑴免疫學分選法：可分為熒光活化細胞分選術(shù)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS) 和免疫磁珠分選術(shù)(magnetic cell sorting，MACS) ，F(xiàn)ACS分選法通過熒光標志的特異性抗體，將表達腫瘤干細胞標志的細胞分離出來，獲得腫瘤干細胞。⑵懸浮培養(yǎng)分選法：Singh 等首次應(yīng)用此方法得到了表型為 CD133+的腦腫瘤干細胞克隆形成的神經(jīng)球樣集落，利用此方法培養(yǎng)出的細胞具有多向分化的潛能，其干細胞比例可達4%～20%，適合用于分離表面標志物未知腫瘤干細胞。⑶功能學分選法，即側(cè)群細胞分選法。

驅(qū)動并維系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤干細胞最本質(zhì)的特征，因此，腫瘤細胞動物移植實驗是檢驗?zāi)[瘤干細胞的“金標準”。將獲得的腫瘤干細胞與其他表型細胞進行比較，由于其在NOD/SCID小鼠體內(nèi)有強致瘤性，可將分離出的待測腫瘤細胞移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，進而追蹤觀察是否會有腫瘤生成及腫瘤的發(fā)展進程，用以評估待測細胞是否具有形成并維持腫瘤生長及異質(zhì)性的能力。為了檢測待測細胞是否具有自我更新能力，具有陽性標記的細胞將從新生的腫瘤內(nèi)可再次分離出來并移植到新的NOD/SCID小鼠體內(nèi)進行檢測，形成的移植瘤灶應(yīng)與原發(fā)腫瘤具有相同的形態(tài)學特征[41]。

除此之外，細胞表面特異性標志是鑒定 CSCs最重要的方法，利用此方法已經(jīng)鑒定出了多種CSCs。通過流式細胞術(shù)分選(FACS)和磁性激活細胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)等方法分選出具有該標記的細胞，再進一步通過干細胞活性及克隆形成、細胞增殖與分化等方法檢測分選出的細胞是否具有腫瘤干細胞的潛能[29-31]。目前，世界上已經(jīng)成功地在急性髓性白血病(AML)、B細胞急性淋巴細胞白血病(B-Acute Lymphoblastic Leukemia，B-ALL)、原始細胞危相慢性粒細胞白血病(Blast-Crisis Chronic Myelocytic Leukemia，Blast-Crisis CML)、膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma)、髓母細胞瘤(Medulloblastoma)、毛細胞型星型細胞瘤(Pilocyticastrocytoma)、間變型室管膜瘤(Anaplastic Ependymoma)、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中成功鑒定分離到腫瘤干細胞的存在[29-34,42]。除表面抗原標記物外，研究人員還發(fā)現(xiàn)某些分子標記物也可以用來實現(xiàn)對腫瘤干細胞的鑒定，如乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)，其活性高低與腫瘤的惡性程度及腫瘤干細胞的自我更新能力的相關(guān)性已先后在乳腺癌[43]、結(jié)腸癌[44]、肺癌[45]及肝癌[46]中得到證實。而在Yamashita等[47]發(fā)現(xiàn)的肝癌細胞中上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)表達陽性的細胞群也具備所有腫瘤干細胞的特性，EpCAM+細胞較EpCAM-細胞具有更強的致瘤能力與侵襲性。在膠質(zhì)瘤以及乳腺癌腫瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞具有26S蛋白酶體活性下降的特性[48]。干細胞和腫瘤干細胞可以表達很多共同的細胞表面標記這一現(xiàn)象，再一次驗證了二者的同源性，幾乎相同的調(diào)控因子很可能既調(diào)控著干細胞同時又調(diào)控著腫瘤干細胞的自我更新、分化以及增殖進程[49]。另外，腫瘤干細胞還具有一些其自身特有的細胞表面抗原標記，這些標記大多和惡性腫瘤中與致癌、轉(zhuǎn)移、復發(fā)相關(guān)的標記相似[42,54]，也表明了腫瘤干細胞與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復發(fā)具有相關(guān)性[50]。

4.3 腫瘤干細胞的轉(zhuǎn)移

腫瘤干細胞不僅和腫瘤的生成密切相關(guān)，而且在腫瘤的整個發(fā)展進程，特別是在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要作用。腫瘤轉(zhuǎn)移，是指癌細胞從腫瘤的原發(fā)灶遷移到其他的器官和組織中，這是一個涉及多步驟的復雜過程，也是臨床上90%以上癌癥患者死亡的原因。很多學者認為腫瘤處于晚期難以根治的原因在于癌細胞產(chǎn)生基因突變，導致對放化療不敏感、患者5年生存率下降。在腫瘤干細胞假說提出后研究人員又提出了轉(zhuǎn)移腫瘤干細胞假說，即在腫瘤干細胞中存在著一部分具有轉(zhuǎn)移能力的轉(zhuǎn)移腫瘤干細胞，轉(zhuǎn)移能力的大小與轉(zhuǎn)移腫瘤干細胞同周圍微環(huán)境之間的關(guān)系有關(guān)[51]。Chen等[52]用造模來觀察癌細胞向遠處的轉(zhuǎn)移，并觀察了這些細胞的各項參數(shù)。研究結(jié)果表明，這些細胞需要很強的活動力和競爭力及轉(zhuǎn)移到遠處后與周圍的正常組織細胞競爭環(huán)境中的養(yǎng)分與生存空間。所以，CSC在向遠處轉(zhuǎn)移過程中，為了適應(yīng)周圍環(huán)境的需要，需要發(fā)生各種表型的改變，而在其達到轉(zhuǎn)移目的地后，自身干細胞特性使其產(chǎn)生優(yōu)勢克隆，從而導致遠處惡性腫瘤的發(fā)生。2009年，Thiery等[53]提出了：腫瘤干細胞的形成、轉(zhuǎn)移甚至耐藥性都與上皮—間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換—EMT及其逆向過程MET之間存在著密切聯(lián)系，在分子水平上更為詳細地解釋并支持了轉(zhuǎn)移腫瘤干細胞的假說，預(yù)示著腫瘤干細胞的分子機制研究已經(jīng)一步步地從初級階段開始走向深入。除此之外，腫瘤干細胞具有更多的遺傳不穩(wěn)定性，也更容易適應(yīng)新環(huán)境存活下來[54]。

5 展望

對腫瘤干細胞的研究已成為當前腫瘤研究的熱點，盡管目前我們在腫瘤干細胞分離、純化及鑒定上取得了很大的進展，但是對腫瘤干細胞的生物學特性、以及它在腫瘤中的分布、數(shù)量都研究和了解得很少，因此，除了繼續(xù)在其他腫瘤組織中分離、鑒定出新的腫瘤干細胞之外，今后的研究工作重心應(yīng)該集中在研究腫瘤干細胞的生物學特征上，了解腫瘤干細胞較其他腫瘤細胞所具有的一些特殊信號調(diào)控路徑，以及其在腫瘤組織中的分布和數(shù)量，這將有助于我們對腫瘤的診斷和預(yù)后判斷。

隨著對腫瘤干細胞研究的深入，以及腫瘤干細胞假說的完善，相信在不久的將來，人們終究會探明腫瘤干細胞的生物學特性，并利用掌握的這把利劍為治愈腫瘤患者開辟出一條光明大道。

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