陳德鑫，許家來，曹君正，武 俠，林北森，孔凡玉*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.山東煙草研究院，濟南 250101；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，青島 266109；4.廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司，廣西 百色 533000）

根結(jié)線蟲是當(dāng)前我國主要的農(nóng)作物病原線蟲之一[1]。根結(jié)線蟲作為煙草主要的病原線蟲，每年對世界煙草生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。迄今尚缺少抗根結(jié)線蟲的商品化作物品種，且與非寄主植物輪作的農(nóng)業(yè)措施在煙草產(chǎn)區(qū)難以施行。采用化學(xué)殺線劑防治根結(jié)線蟲病，由于土壤殘留、環(huán)境破壞及吸食對人不安全等因素，有的化學(xué)殺線劑已經(jīng)被禁用，有的即將被禁用。迄今為止生產(chǎn)上尚無安全有效的防治煙草根結(jié)線蟲病害措施，促使人們開始尋求更為安全有效的防治手段，生物防治是目前國內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點，也是根結(jié)線蟲可持續(xù)治理的理想途徑之一[2-3]。

刀孢蠟蚧菌 Lecanicillium psalliotae（syn Verticillium psalliotae）對根結(jié)線蟲的生物防治具有重要的應(yīng)用潛力。該菌寄主范圍很廣，既能寄生根結(jié)線蟲卵和 2齡幼蟲[4-7]、胞囊類線蟲[4]和腐生線蟲[8]，也能寄生大豆銹病等多種病原真菌[9-11]及多種農(nóng)業(yè)害蟲[12-15]，具有很大的生物防治應(yīng)用潛力。目前未見該菌對煙草根結(jié)線蟲的生物防治潛力評價。

本研究通過該菌離體條件下對分離自煙草根結(jié)線蟲卵和雌蟲的寄生測定及對煙草根結(jié)線蟲病害的田間防效測定，探明該菌對煙草根結(jié)線蟲的生防潛力，為進一步開發(fā)和利用該菌奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

刀孢蠟蚧菌 Lecanicillium psalliotae CGM CC5329（QNCSE0810）由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲研究室提供。

1.2 刀孢蠟蚧菌對根結(jié)線蟲卵、雌蟲的寄生及卵孵化抑制的測定

本試驗于2010年5月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲學(xué)研究室進行，將采自云南被南方根結(jié)線蟲侵染的煙草病根洗凈，直接挑取新鮮的卵塊和健康雌蟲。用1%次氯酸鈉震蕩分離新鮮的卵塊，收集游離卵，制成每毫升 3000個卵的懸浮液。刀孢蠟蚧菌對煙草根結(jié)線蟲卵、雌蟲寄生及卵孵化抑制的測定試驗設(shè)計參見文獻[7]。

1.3 刀孢蠟蚧菌菌劑的制備

將干燥麥麩加入營養(yǎng)液（0.2% K2HPO4，0.1%KH2PO4，0.3% KNO3，0.001% FeSO4，0.03% NaCl，0.03% MgSO4·7H2O，0.3% Tryptone）并充分混勻，使麥麩濕度達70%后，裝入1000 mL三角瓶1/2處，121 ℃滅菌30 min 備用。挑取PDA平板上27 ℃、6 d的純培養(yǎng)物邊緣直徑6 mm菌塊，加入三角瓶中，每瓶放菌塊10個。27 ℃暗箱培養(yǎng)，每天搖瓶3次，使之充分發(fā)酵。7 d后取出自然晾干備用。

1.4 刀孢蠟蚧菌菌劑的田間防效測定試驗設(shè)計

試驗于 2010—2011年在山東諸城市、廣西百色市進行。諸城市相州鎮(zhèn)高戈莊村往年發(fā)生根結(jié)線蟲病較重的地塊，土壤為褐土，肥力中等；百色市隆林縣蛇場鄉(xiāng)大壩屯，根結(jié)線蟲病較重的地塊，土壤為紅壤土，肥力中等。供試品種為紅花大金元，是南方根結(jié)線蟲感病品種。

試驗共設(shè)5個處理水平，即施菌劑30、15、7.5、5、0 kg/667m2，0為CK。菌劑在烤煙移栽時一次全部施入。小區(qū)面積33 m2，每區(qū)50株，3次重復(fù)，完全隨機排列，處理間設(shè)保護行，按優(yōu)化栽培管理煙草。采收期采用 5點取樣法，每點定株調(diào)查 25株，調(diào)查煙草根結(jié)線蟲病的病株率，并計算病情指數(shù)。采收期煙株拔根調(diào)查計算根結(jié)指數(shù)。根據(jù)病株率、根結(jié)指數(shù)計算相對防效，相對防效計算方法見文獻[16]。收獲期根結(jié)嚴重度的分級標準[17]為0級：無根結(jié)；1級：1/3以下根系上有少量根結(jié)；2級：1/3～1/2根系上有根結(jié)；3級：1/2以上根系上有根結(jié)，少量根結(jié)上再產(chǎn)生根結(jié)；4級：幾乎所有根系上長滿根結(jié)，甚至連結(jié)成根結(jié)團塊。計算公式[18]：

根結(jié)指數(shù)=∑（各級植株數(shù)×相應(yīng)級值）／（調(diào)查總株數(shù)×最高級別代表值）×100

相對防效＝（對照根結(jié)指數(shù)－處理根結(jié)指數(shù)）／對照根結(jié)指數(shù)×100%

2 結(jié) 果

2.1 刀孢蠟蚧菌對南方根結(jié)線蟲卵的寄生

卵內(nèi)充滿菌絲以及胚胎和1齡幼蟲被破壞的卵定義為被寄生的卵。培養(yǎng)5 d后寄生率為83.29%。被寄生的卵被菌絲穿透卵殼，在卵表面形成菌網(wǎng)，有的卵殼皺縮凹陷甚至破裂，內(nèi)容物外滲（圖1A）；菌絲侵入卵內(nèi)，在卵內(nèi)生長，使卵內(nèi)容物凝集，胚胎發(fā)育停止，卵殼變形，卵殼內(nèi)充滿菌絲并產(chǎn)生鐮刀形分生孢子（圖1B）。未接菌的卵殼初期表面光滑，內(nèi)容物均勻（圖1C），3 d后可見明顯的胚胎發(fā)育（圖1D），5 d后孵化出2齡幼蟲破殼而出。

2.2 刀孢蠟蚧菌對南方根結(jié)線蟲雌蟲的寄生

觀察接菌培養(yǎng)基上的年輕雌蟲，菌絲接觸雌蟲體壁形成致密菌網(wǎng)和侵染釘，穿透雌蟲體壁，體壁皺縮變形，內(nèi)含物外滲（圖2B）。未接菌培養(yǎng)基上的雌蟲，外殼表面光滑，內(nèi)含物均勻完整（圖2A）。

圖1 刀孢蠟蚧菌對南方根結(jié)線蟲卵的寄生過程Fig.1 Parasitic process of L.psalliotae to M.incognita eggs

圖2 刀孢蠟蚧菌對南方根結(jié)線蟲雌蟲的寄生Fig.2 Parasitism of L.psalliotae to the female of M.incognita

2.3 刀孢蠟蚧菌對卵孵化的抑制效果

未接菌的卵塊解離48 h后孵化率為78.8%。接菌的卵塊，解離后卵殼表面粗糙，卵質(zhì)發(fā)黑，48 h后孵化率僅為5.7%，胚后發(fā)育期的卵表面粗糙，表明卵內(nèi)幼蟲亦被寄生。刀孢蠟蚧菌對南方根結(jié)線蟲卵塊寄生后的卵孵化抑制率為92.77%。

2.4 刀孢蠟蚧菌對煙草根結(jié)線蟲的相對防效

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施用菌劑量為 30 kg/667m2時，有燒苗現(xiàn)象，植株長勢矮小，葉片泛黃，根系變褐腐爛，直至萎蔫死亡。由表1可以看出，其他處理均有一定的防效，當(dāng)菌劑施用量為15 kg/667m2時防效最好，達80%以上，根系發(fā)達，根結(jié)少而小，有的很難找到根結(jié)（圖 3A、C）。對照組呈明顯雞爪狀，須根少，根結(jié)多而大（圖3B、D）。

2.5 刀孢蠟蚧菌對煙草長勢的影響

表1 不同處理根結(jié)線蟲根結(jié)指數(shù)及防效Table1 Effects of different treatments on root-knot index and relative control effect

從采收初期至采收完最后一片煙葉，隨機取煙葉測量葉面積，在采收最后一片煙葉后，各小區(qū)隨機取15 株測量其株高、莖圍和鮮質(zhì)量。結(jié)果表明，除施用30 kg/667m2菌劑的處理外，其他處理在株高、葉面積指數(shù)、莖圍和鮮質(zhì)量均優(yōu)于對照，株高、葉面積指數(shù)、莖圍測量及計算方法參照文獻[19]。其中施用15 kg/667m2菌劑的處理最為明顯（表2、3）。

3 討 論

刀孢蠟蚧菌CGMCC5329對煙草根結(jié)線蟲卵和卵塊具有很強的寄生能力和孵化抑制作用，對卵的寄生率第5天為83.29%，與曹君正等[7]報道的寄生率相近，對卵塊的孵化抑制率為91.41%。這與Eapen等[20]報道的高效菌株蠟蚧菌Verticillium lecanii V1對卵塊的孵化抑制率相近。刀孢蠟蚧菌CGMCC5329對不同時期的卵均有侵染能力，但胚前發(fā)育期卵的寄生率明顯高于胚后發(fā)育期卵。線蟲的卵殼是防御土壤微生物侵入的有效屏障，主要由幾丁質(zhì)（約占40%）和蛋白質(zhì)構(gòu)成[21]。這可能是在侵染過程中，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和蛋白酶分解卵殼[22]。

表2 不同處理對煙草長勢的影響（山東）Table2 Effects of different treatments on morphological indices of tobacco plants (Shandong)

表3 不同處理對煙草長勢的影響（廣西）Table3 Effects of different treatments on morphological indices of tobacco plants (Guangxi)

本試驗用麥麩作為菌劑發(fā)酵的主要培養(yǎng)基，在施用量為30 kg/667m2時，有明顯的燒苗現(xiàn)象，這可能與麥麩降解不充分且在土壤中的濃度過高，施入土壤后，通過自然降解產(chǎn)生大量氨氣等造成燒苗。試驗結(jié)果表明施用量為15 kg/667m2時，防治效果最好，且相對防效與長勢情況與楊有才等[23]和祝明亮等[24]報道的結(jié)果類似。

煙草根結(jié)線蟲的生物防治在資源普查、高效菌株篩選、生防菌劑的研制及田間試驗等方面前人已經(jīng)做了大量研究工作[25]。但是，由于生防菌株在復(fù)雜土壤微生態(tài)環(huán)境的影響下，生防菌劑防效很難達到理想效果，本研究是在未考慮土壤環(huán)境等因素的前提下進行的，且取得了較為理想的效果，說明該菌株可以作為高效生防菌株進行更深入的研究。對于該菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性及其與土壤微生態(tài)環(huán)境共存穩(wěn)定性，需要做進一步研究，同時進一步評價溫室和大田中影響該菌定殖及發(fā)揮防效的關(guān)鍵生態(tài)因子，以便為該菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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