龍俊任，董自強(qiáng)，熊 飛，胡敬祖，侯 毅，韓 鈺

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443003;2三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所)

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(HGF/c-Met)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及腫瘤組織的血管形成等過程中發(fā)揮著重要作用［1］。2009年10月～2011年5月，我們采用RT-PCR法和免疫組化法檢測(cè)膀胱癌組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 膀胱癌患者47例，男29例、女18例，年齡30 ～82 歲;臨床分期 T1～2期 15 例，T3～4期32例;病理分化為低分化28例，高分化19例。患者術(shù)前均未行放療和化療，術(shù)中留取膀胱癌組織及其癌旁組織標(biāo)本各47例。將術(shù)中切除的新鮮組織標(biāo)本分成2份:1份立即放入液氮中保存;另1份用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 MACC1、c-MetmRNA 檢測(cè)方法 采用 RTPCR法。用RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，并定量RNA純度及濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。引物由上海生物工程有限公司合成。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，55 ℃(56 ℃，β-actin)退火 30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)(28個(gè)，β-actin)循環(huán)后于72℃延伸5 min;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，Gel Logic-200凝膠成像系統(tǒng)掃描分析測(cè)定電泳條帶相對(duì)吸光度值;以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算 MACC1、c-MetmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 MACC1和c-Met蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化SABC法。用石蠟包埋膀胱癌及癌旁組織，4 μm層厚連續(xù)切片，脫蠟、修復(fù)，常規(guī)SABC免疫組化染色。光鏡下觀察，棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。無著色為0分，著淡黃色為1分，著黃色為2分，著黃棕或棕褐色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。兩項(xiàng)得分相乘≤1分為陰性，＞1分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌及癌旁組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達(dá) 見表1。

表1 膀胱癌及癌旁組織中MACC1、c-MetmRNA及其蛋白的表達(dá)情況

2.2 MACC1和c-Met蛋白表達(dá)與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MACC1、c-Met蛋白表達(dá)與膀胱癌的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，見表2。

表2 MACC1、c-Met表達(dá)與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

MACC1基因首先在人結(jié)腸癌組織中被鑒定出來，位于人類的7號(hào)染色體上(7p21.1)，其生物學(xué)功能廣泛，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化等方面起著重要作用，是調(diào)節(jié)HGF/c-Met通路中Met基因的關(guān)鍵因子［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，MACC1在許多的正常人體組織中均呈低水平表達(dá)，但在多種腫瘤組織表達(dá)都明顯增高，認(rèn)為可以把MACC1蛋白作為一種新的腫瘤診斷標(biāo)志物［2～6］。

本研究顯示，MACC1和c-MetmRNA及其蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)量均顯著高于癌旁組織(P均＜0.05)，且與膀胱癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，說明兩者在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有學(xué)者在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及腎癌細(xì)胞中證實(shí)，siRNA-MACC1能夠抑制細(xì)胞中MACC1蛋白的表達(dá)，而c-Met蛋白的表達(dá)也明顯下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯降低，推測(cè)異常表達(dá)的MACC1可激活下游的HGF/c-Met信號(hào)通路，增加c-Met蛋白的表達(dá)，兩者協(xié)同增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［3，7～9］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí):①M(fèi)ACC1與HGF/c-Met之間存在一個(gè)正反饋環(huán)路:HGF促進(jìn)MACC1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與c-Met的啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)c-Met的轉(zhuǎn)錄，c-Met的表達(dá)可以增強(qiáng)HGF的作用;②HGF/c-Met還可以激活下游靶基因 MAPK，而 MAPK信號(hào)通路可激活MACC1啟動(dòng)子，明顯提高M(jìn)ACC1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分裂［8］。利用siRNA-MACC1不僅可下調(diào)MACC1蛋白表達(dá)，降低卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3的惡性潛能，并下調(diào)其下游 Met、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Cyclin D1、MMP2 蛋白表達(dá)，但 Capase-3 的表達(dá)卻是升高的［10］。MACC1和c-Met兩者結(jié)合的機(jī)制可能是MACC1基因可結(jié)合在原癌基因Met基因啟動(dòng)子近端約60 bp的啟動(dòng)子片段上，其中包括一個(gè)特異性的Sp1結(jié)合位點(diǎn)，而這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是MACC1誘導(dǎo)的Met基因表達(dá)和HGF/c-Met信號(hào)通路激活所必需的［1，6，11］。

目前，c-Met已被開發(fā)作為膀胱腫瘤基因治療及藥物治療的靶分子［12］。隨著對(duì)MACC1和c-Met相關(guān)性研究的深入，可能為膀胱癌的臨床治療開辟一條新的路徑。

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