(蘇州大學(xué)附屬第四醫(yī)院，江蘇無錫214062)

核糖核苷酸還原酶M1(RRM1)高表達(dá)是吉西他濱耐藥的主要機(jī)制之一［1］，因此檢測癌組織中RRM1的表達(dá)情況可用以判定吉西他濱治療的效果。2008年2月～2011年5月，觀察了晚期NSCLC組織中RRM1蛋白及其mRNA的表達(dá)變化，為通過RRM1表達(dá)水平指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年2月～2010年5月我院收治的NSCLC患者54例，男32例、女22例，年齡49～83歲;有吸煙史者35例?；颊呒韧唇邮苓^任何抗腫瘤治療，且無法手術(shù)切除;均經(jīng)支氣管鏡下活檢或穿刺活檢確診，其中鱗癌18例，腺癌33例，其他3例;臨床分期ⅢB期25例，Ⅳ期29例。

1.2 化療及療效判定方法 患者均給予GP方案化療。第1、8天靜注吉西他濱1 000 mg/m2，第1天靜注順鉑75 mg/m2，28 d為1個周期。治療1個周期后評價(jià)化療效果，按WHO與國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)與疾病進(jìn)展(PD)。有效為CR+PR+SD，有效者應(yīng)1個月后再次檢查確認(rèn)。生存期為患者治療開始至死亡或失訪的時間。

1.3 RRM1 mRNA及蛋白檢測方法

1.3.1 RRM1蛋白檢測方法 收集活檢標(biāo)本，4%甲醛固定，常規(guī)包埋制片;采用免疫組化(IHC)法檢測，按說明書操作。RRM1陽性細(xì)胞為胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比≥5%為RRM1陽性，＜5%為RRMl陰性。

1.3.2 RRM1 mRNA檢測方法 采用 PCR?；顧z組織離體后液氮保存，研碎后按Trizol RNA抽提純化說明書的方法抽提組織總RNA。將提取的組織總RNA，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H－)kit說明書操作逆轉(zhuǎn)錄呈 cDNA。熒光定量PCR儀為購至ABI公司的7300，內(nèi)參基因是β-actin，引物和探針由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共20μL:2×realtime PCR buffer 10 μL，dNTP 1 μL，前向引物、后向引物、ROX 各 0.4 μL，模板2μL，加水補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 變性 10 min，然后95℃ 變性 20 s，60℃退火并延伸1 min為1個循環(huán)，40個循環(huán)。RRM1的Ct值與β-actin的Ct值之差，即ΔCt，以中位ΔCt為標(biāo)準(zhǔn)，ΔCt值≥中位值為低表達(dá)，＜中位值為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中RRM1蛋白及mRNA表達(dá) 本組54例晚期NSCLC患者中，RRM1蛋白陽性22例(40.7%)，陰性32例;RRM1 mRNA高表達(dá)27例(50.0%)，低表達(dá)27 例。二者比較，P ＞0.05。

2.2 NSCLC組織中 RRM1 mRNA及蛋白表達(dá)與GP方案療效、生存時間的關(guān)系 RRM1蛋白陰性者化療有效率為46.9%，高于陽性者的27.3%(P＜0.05)。RRM1 mRNA低表達(dá)者的化療有效率為51.9%，高于高表達(dá)者的25.9%，但是差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織中RRM 1 mRNA及蛋白表達(dá)與GP方案療效、患者生存時間的關(guān)系

3 討論

吉西他濱是目前NSCLC的主要化療藥物，它是脫氧胞苷的結(jié)構(gòu)類似物，能夠被脫氧核苷激酶和單磷酸脫氧核苷激酶磷酸化成二磷酸脫氧胞嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物，與核糖核酸還原酶(RNR)結(jié)合，抑制RNR的活性，從而抑制DNA的合成，是目前主要的RNR抑制劑［1］。RRM1是 RNR的重要亞基之一，除參與脫氧核苷酸的合成外，在DNA的修復(fù)中也扮演重要的角色。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，DNA的修復(fù)機(jī)制在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及治療中似乎扮演著雙面角色。一方面，DNA合成修復(fù)機(jī)制差的細(xì)胞容易發(fā)生癌變，但另一方面，如果腫瘤細(xì)胞中DNA合成修復(fù)過強(qiáng)恰恰造成對化療藥物耐藥［2，3］。所以，多數(shù)研究認(rèn)為，腫瘤組織中RRM1低表達(dá)者較易從吉西他濱相關(guān)的治療方案中受益，使RRM1檢測成為肺癌個體化治療研究的熱點(diǎn)［4～10］。

本研究應(yīng)用PCR和IHC的方法，從mRNA和蛋白水平分別檢測了同一組標(biāo)本中的RRM1表達(dá)情況，并分析了其與吉西他濱治療效果之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，IHC法檢測的RRM1蛋白陰性者的疾病緩解率、1年生存率、中位生存期均高于陽性者(P均 ＜0.05)，與 Yang等的報(bào)道結(jié)果一致［5］。PCR 檢測的RRM1基因低表達(dá)者化療有效率雖高于高表達(dá)者但P＞0.05，RRM1基因低表達(dá)者的1年生存率、中位生存期均高于高表達(dá)者(P均＜0.05)，與王臨潤等的報(bào)道結(jié)果相似［6］。

我們進(jìn)一步比較了兩種方法之間的差異，兩者的一致性為75.9%;在陰性組中，PCR低表達(dá)者中的有效率(51.9%)高于IHC檢測陰性者(46.9%)，但受益率(81.5%)低于IHC檢測陰性者(87.5%)，且PCR法無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR檢測以中位值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，將研究對象分為均等的兩組，即陰性率和陽性率永遠(yuǎn)為50%;IHC在確定了陽性標(biāo)準(zhǔn)后將研究對象分為兩組。就本研究來看，IHC檢測陰性者納入了更多的患者，陰性率為59.3%。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，IHC檢測確定為陰性的患者中有9例PCR確定為高表達(dá)，而PCR確定為低表達(dá)者中有4例IHC檢測確定為陽性。進(jìn)一步分析這13例標(biāo)本，我們發(fā)現(xiàn)有8例誤判標(biāo)本其表達(dá)值臨近判斷標(biāo)準(zhǔn);但是，還有5例為IHC檢測陰性、PCR檢測高表達(dá)，PCR表達(dá)值遠(yuǎn)離判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合HE切片，我們發(fā)現(xiàn)這5例標(biāo)本中4例炎癥較為嚴(yán)重，伴隨大量炎細(xì)胞浸潤，1例伴有較嚴(yán)重的出血。所以我們推斷，這5例標(biāo)本PCR和IHC結(jié)果出現(xiàn)較大偏差的原因可能與大量炎細(xì)胞浸潤有關(guān)?？梢奍HC在一定程度上能夠更好的避免假陽性和假陰性，要優(yōu)于PCR法，能讓更多NSCLC患者受益于吉西他濱治療。當(dāng)然，這一結(jié)論還需要更多的實(shí)驗(yàn)在更大的標(biāo)本上去進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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