(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

脂多糖(LPS)對牙周炎及牙髓炎發(fā)病的作用已有較多研究，然而慢性牙周炎狀態(tài)下，LPS對牙髓組織的作用，鮮見報道。2011年5月～2012年1月，我們通過局部注射LPS建立慢性牙周炎大鼠模型，觀察LPS對牙髓細(xì)胞生物活性以及修復(fù)性牙本質(zhì)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量250～300 g。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 LPS(Sigma，USA)，用雙蒸水稀釋至2 mg/mL，過濾除菌后制成LPS溶液備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 牙周炎動物模型的建立 將大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)行腹腔麻醉，取仰臥位，將四肢及上頜固定于手術(shù)板上。以75%乙醇消毒口腔，大鼠以左側(cè)上頜磨牙為對照側(cè)，右側(cè)上頜磨牙為實驗側(cè)。分別在實驗側(cè)上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)自齦溝注射2 mg/mL的LPS各0.1 mL，隔天重復(fù)注射，3次/周，直至處死動物前。每周觀察實驗側(cè)與對照側(cè)牙齦顏色及充血狀況，并拍X線牙片觀察牙周炎形成情況。

1.2.2 模型大鼠牙周、牙髓狀態(tài)及修復(fù)性牙本質(zhì)形成的觀察 造模第3、5周分別隨機處死6只大鼠，迅速分離上頜骨，甲醛固定;去除牙周軟組織后，用精確到0.05 mm的游標(biāo)卡尺測定第1、2磨牙頰側(cè)近中、正中、遠(yuǎn)中及舌側(cè)近中、正中、遠(yuǎn)中6個位點的牙槽骨吸收值，取平均值。另8只大鼠于造模第3、5周處死，每次4只，迅速分離上頜骨，甲醛固定;10%硝酸脫鈣8 h，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，矢狀面5μm厚連續(xù)切片;切片鋪于多聚賴氨酸包被的玻片上，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠對照側(cè)牙齦組織呈粉紅色，無充血水腫，無炎癥性改變，牙齦無萎縮，X線檢查牙槽骨無吸收。實驗側(cè)牙齦輕微紅腫，探診易出血，去除軟組織后可見牙槽骨吸收;造模第5周時，X線檢查大鼠牙槽骨吸收明顯，牙槽嵴頂消失，硬骨板模糊不清;牙槽骨吸收超過根長1/3，但未超過根長1/2。大鼠對照側(cè)與實驗側(cè)磨牙牙槽骨吸收值比較，見表1。

表1 大鼠對照側(cè)與實驗側(cè)磨牙牙槽骨吸收值比較(mm，±s)

表1 大鼠對照側(cè)與實驗側(cè)磨牙牙槽骨吸收值比較(mm，±s)

注:與正常側(cè)比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與同側(cè)第 1磨牙比較，#P ＜0.05

上頜磨牙牙槽骨吸收值造模第3周 造模第5周磨牙實驗側(cè) 0.95 ±0.11*0.97 ±0.05* 1.95 ±0.10△1.55 ±0.10*#第1磨牙 第2磨牙 第1磨牙 第2 0.27 ±0.05 0.28 ±0.05 0.28 ±0.05 0.29 ±0.04正常側(cè)

造模第5周，病理切片發(fā)現(xiàn)大鼠實驗側(cè)牙周袋形成，牙槽骨破壞呈陷窩狀吸收，牙槽骨內(nèi)可見多處破骨細(xì)胞，牙槽嵴頂吸收低平。成牙本質(zhì)細(xì)胞減少，排列紊亂，發(fā)生空泡性變;炎癥細(xì)胞浸潤，可見修復(fù)性牙本質(zhì)形成;牙本質(zhì)小管彎曲，數(shù)目減少，有些區(qū)域甚至不含小管。

3 討論

3.1 牙周炎模型的建立 牙周病是由G－菌引起的慢性感染性疾病，LPS是G－菌細(xì)胞外膜的主要成分，其對牙周組織有很高的毒性。牙周感染時細(xì)菌內(nèi)毒素及多種炎性因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化、增殖，抑制成骨細(xì)胞活性，牙槽骨代謝平穩(wěn)失調(diào)，是引起牙槽骨吸收的主要因子，可直接和間接導(dǎo)致牙槽骨吸收［1，2］。LPS不僅自身能導(dǎo)致骨吸收，還可作為一個促進因子，與其他骨吸收因子產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使其骨吸收能力得以加強［3，4］。由于LPS具有高度保守性，活性基本一致，而大腸桿菌的LPS結(jié)構(gòu)與伴放線放線桿菌結(jié)構(gòu)類似［5］，致病性基本一致，所以本實驗選用大腸桿菌的LPS代替牙周致病菌建立模型。

本實驗采用2 mg/mL的LPS來建立牙周炎動物模型，第3周時即形成牙周炎動物模型，可見牙齦輕微紅腫，探診出血，牙槽骨開始破壞吸收;第5周時，X線片顯示牙槽骨吸收明顯，超過根長1/3但未超過根長1/2。該病程進展慢于其他研究，可能由于藥物濃度、處理方式等差異造成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第5周對照側(cè)與實驗側(cè)牙槽骨吸收值有統(tǒng)計學(xué)意義，證明單純用LPS注射法建立牙周炎模型是可行的。第5周時實驗側(cè)第1磨牙比第2磨牙吸收明顯，可能因為第1磨牙位置靠前、利于注射，或者大鼠咀嚼以第1磨牙為主等原因所致。同時，本研究用X線確定牙槽骨吸收的方法，與人類臨床判斷牙周炎的方法相似，形成的牙周炎模型牙槽骨吸收明顯，更接近于人類牙周炎的臨床發(fā)病狀態(tài)。

3.2 LPS對牙髓、修復(fù)性牙本質(zhì)形成的影響 研究表明，LPS直接作用牙髓組織，可導(dǎo)致粒細(xì)胞、血小板向血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，血小板凝集，出現(xiàn)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等血液循環(huán)系統(tǒng)障礙［6］;同時，LPS對細(xì)胞周期有抑制作用，可以抑制細(xì)胞增殖，影響牙髓細(xì)胞的損傷修復(fù)［7］。侯本祥等［8］報道，用 5 mg/mL的LPS開髓直接暫封，1周后成牙本質(zhì)細(xì)胞減少，根管壁周圍有少量修復(fù)性牙本質(zhì)形成;2周后冠部牙髓部分壞死，仍可見炎細(xì)胞浸潤;髓腔周圍有牙本質(zhì)小管較少的修復(fù)性牙本質(zhì)形成，以根管內(nèi)最為顯著。然而本實驗觀察到，LPS局部注射形成牙周炎時，與LPS直接刺激牙髓時的反應(yīng)相類似。

牙齒在受到齲壞、機械、化學(xué)損傷、感染、磨損等多種刺激后，牙髓組織都會有修復(fù)反應(yīng)［9］。牙周炎時牙周袋內(nèi)的LPS及其刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可以通過根尖孔、根管側(cè)支和牙本質(zhì)小管，對牙髓和牙本質(zhì)造成慢性、小量的刺激，引起修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。炎癥可能是修復(fù)過程中潛在的關(guān)鍵因素。炎癥事件激活干(祖)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，炎癥細(xì)胞或者牙髓成纖維細(xì)胞進行表型轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞/成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，形成修復(fù)性牙本質(zhì)。修復(fù)性牙本質(zhì)既可能是牙髓自身修復(fù)的反應(yīng)，也可能是一種牙髓刺激反應(yīng)［10］。

綜上所述，本實驗用局部注射內(nèi)毒素LPS的方法成功構(gòu)建了牙周炎動物模型，并觀察到了成牙本質(zhì)細(xì)胞的空泡性變及修復(fù)性牙本質(zhì)形成等，這為研究牙周所致牙髓病變的發(fā)病機制提供了重要的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

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