(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，雌激素—雌激素受體(ER)有兩種亞型ERα(-A、-B、-C)、ERβ。近年來，關(guān)于腫瘤組織中抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化成為研究的一個新熱點。抑癌基因的沉默、DNA的錯配修飾都與其相關(guān)基因甲基化改變密切相關(guān)［1～4］。2011年5～9月，我們觀察了DNA甲基化抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷(ADC)處理前后子宮內(nèi)膜癌細胞中ERα各亞型的甲基化狀態(tài)及其蛋白表達的變化，探討ERα各亞型CPG島甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa(ER高表達)由北京大學(xué)人民醫(yī)院惠贈，HEC-1B細胞系(ER低表達)購自中國生命科學(xué)院上海細胞庫，均經(jīng)傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。離心柱型DNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，Zymo Research EZ DNA Methylation Kit購自 Promage公司，ADC購自Sigma公司，ER多單隆抗體購自Santa Cruz公司。參考文獻設(shè)計［5］各引物序列，由Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ADC對子宮內(nèi)膜癌細胞最佳抑制濃度的確定 采用MTT法。取對數(shù)生長期的Ishikawa和HEC-1B消化傳代后，以3×103/孔接種96孔板，待細胞貼壁后，觀察組分別加入終質(zhì)量濃度為1、2、4、8μg/mL的ADC培養(yǎng)72 h，對照組不加ADC;再加入0.5%MTT 20μL培養(yǎng)4 h，棄上清;每孔加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定每孔490 nm波長處光密度(OD)值。計算細胞增殖抑制率，確定ADC最佳抑制濃度。細胞增殖抑制率=(1－觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 ADC處理前后ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測 采用甲基化特異性PCR(MSP)法。取ADC最佳抑制濃度處理前后的Ishikawa和Hec-1B，按DNA提取試劑盒(離心柱法)說明抽提細胞DNA;采用 Zymo Research EZDNA Methylation Kit對提取的DNA進行甲基化處理(純化和修飾)，以修飾后的DNA為模板進行PCR擴增，從而檢測ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

1.2.3 ADC處理前后 ERα蛋白表達檢測 取ADC最佳抑制濃度處理前后的Ishikawa和Hec-1B，用細胞裂解液提取細胞內(nèi)總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。采用Western blot法檢測ERα蛋白，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，按說明書操作，以ERα與內(nèi)參β-actin的吸光度值的比值作為ERα蛋白的相對表達量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較采用多樣本單因素方差分析及t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ADC處理后Ishikawa和Hec-1B細胞的增殖抑制率 兩種細胞增殖抑制率均增加，并在1～4μg/mL呈劑量依賴性(P均＜0.05);4μg/mL時ADC抑制效應(yīng)最大，故以4μg/mL為ADC的最佳抑制濃度。見表1。

表1 不同濃度ADC處理后子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

表1 不同濃度ADC處理后子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖抑制率(%，±s)

ADC(μg/mL)細胞增殖抑制率Ishikawa Hec-1B 1 20.14 ±0.12 22.91 ±0.12 2 42.66 ±0.94 51.13 ±0.10 4 66.72 ±0.58 69.92 ±0.67 8 70.33 ±0.53 73.25 ±0.58

2.2 ADC處理前后子宮內(nèi)膜癌細胞ER各亞型啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) 對Ishikawa和Hec-1B細胞采用4μg/mL ADC處理，MSP結(jié)果顯示，ADC處理前ERα和ERβ各亞型中，只有ERα-C出現(xiàn)甲基化條帶，其他各亞型出現(xiàn)非甲基化條帶;ADC處理后ERα-C甲基化條帶消失，出現(xiàn)非甲基化條帶，其他各亞型非甲基化條帶不變。

2.3 ADC處理前后子宮內(nèi)膜癌細胞ERα蛋白表達情況 ADC處理前后子宮內(nèi)膜細胞ERα蛋白相對表達量比較，見表2。

表2 ADC處理前后子宮內(nèi)膜癌細胞ERα蛋白相對表達量比較(±s)

表2 ADC處理前后子宮內(nèi)膜癌細胞ERα蛋白相對表達量比較(±s)

注:與同細胞系處理前比較，*P＜0.01

子宮內(nèi)膜癌細胞ERα蛋白處理前 處理后Ishikawa 83.19 ±4.12 161.33 ±9.71*Hec-1B 62.24 ±7.93 129.66 ±7.09*

3 討論

ER屬于類固醇受體超家族，與雌激素結(jié)合后以二聚體的形式與DNA激素反應(yīng)元件結(jié)合。通過募集共激活子和普通轉(zhuǎn)錄因子與激素反應(yīng)基因的啟動子結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄，激活靶細胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［6］。維持子宮內(nèi)膜正常功能依賴于雌激素的作用，ER作為雌激素所控制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其正常表達對子宮內(nèi)膜細胞分化和功能至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜癌組織中ER陽性率明顯降低。Ali等［7］在人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中發(fā)現(xiàn)，高水平的ERα通過抑制血管生成旁路而對子宮內(nèi)膜癌有抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ER基因的啟動子區(qū)和外顯子1區(qū)富含CpG島，甲基化可能是ER表達降低的主要原因。Shiozawa等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ER蛋白的表達與其基因的甲基化呈反向相關(guān)，93%ER陽性的子宮內(nèi)膜癌其甲基化均為陰性，而83%甲基化陽性的腫瘤其ER表達則為陰性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ERα-A、ERα-B、ERα-C和ERβ中，只有 ERα-C基因存在甲基化。這與Sasaki等［8］的研究結(jié)果相一致。

DNA異常甲基化能使基因表達沉默、基因組DNA不穩(wěn)定性增加，但DNA甲基化引起的基因型的變化又是可逆的、早期的。已有研究［9］表明，子宮內(nèi)膜組織中ERα表達較ERβ多，表達范圍更廣泛，因而有學(xué)者認為在子宮內(nèi)膜癌的病因中，雌激素主要通過ERα發(fā)揮作用。目前，公認內(nèi)分泌治療對晚期或復(fù)發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者有效，可以延長患者生存時間。內(nèi)分泌治療的關(guān)鍵是恢復(fù)雌孕激素受體的表達，如果能在ER陰性細胞中恢復(fù)其表達，內(nèi)分泌治療也會再次有效。本研究對子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa和Hec-1B給予去甲基化處理，加入去甲基化藥物ADC后，ERα-C甲基化條帶消失，ERα蛋白表達明顯增強。證明ERα-C啟動子的甲基化可以導(dǎo)致ER蛋白表達降低，子宮內(nèi)膜癌中ER的低表達或失表達與 ERα-C啟動子的甲基化密切相關(guān)。DNA甲基化是一種可逆過程，應(yīng)用DNA甲基化抑制劑可以使一些重要基因發(fā)生去甲基化，恢復(fù)正常功能。目前，ADC已應(yīng)用于臨床實驗作為常規(guī)化療方案的補充，用于治療兒童白血病等腫瘤，這將為我們臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供新的方向，而今后更多的DNA甲基化抑制劑出現(xiàn)，將為臨床藥物治療子宮內(nèi)膜癌提供新的方法。

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