(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，合肥230061)

熊果酸(UA)廣泛存在于天然植物和中草藥中，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能［1～4］。熊果酸納米脂質(zhì)體微粒(UA-PL-NP)具有溶解性高、吸收性強、生物利用度高及靶向治療特點［5］，提高了UA對腫瘤細胞的殺傷作用［6］。2011年4～11月，我們觀察了UA-PL-NP對人胃癌細胞株SGC-7901增殖活性的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SGC-7901由安徽醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)教研室提供;UA-PL-NP(Sigma公司)用生理鹽水溶解，儲備濃度為20 mg/L;HG-DMEM，胎牛血清，胰蛋白酶;MTT，瑞姬染液，Caspase-3蛋白抗體及S-P免疫組化試劑盒;CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀(ELX-800);Eppendorf 5417r臺式高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 UA-PL-NP對SGC-7901細胞增殖影響的觀察 調(diào)整細胞懸液濃度為5.0×104/mL，200μL/孔接種96孔板。對照組不加藥物，觀察組分別加入0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L 的 UA-PL-NP。每組及各濃度亞組的UA-PL-NP，均設(shè)5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，采用 MTT法觀察細胞增殖情況，按說明書操作，在酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。各組實驗重復(fù)3次，取均值。細胞增殖抑制率=(對照組A值－觀察組A值)/對照組A值×100%;用直線回歸法測定中效濃度，即IC50。

1.2.2 UA-PL-NP對SGC-7901細胞凋亡影響的觀察 調(diào)整細胞懸液濃度為5.0×104/mL，以每孔2 mL接種預(yù)置蓋玻片的24孔板。對照組常規(guī)培養(yǎng)，觀察組每孔加入3.73 mg/L的UA-PL-NP;培養(yǎng)72 h后，PBS洗滌3次;4%多聚甲醛室溫固定20 min后，再用PBS洗滌3次;取出蓋玻片用瑞氏染色法染色，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 UA-PL-NP 對SGC-7901細胞中Caspase-3蛋白表達影響的觀察 分組及處理同1.2.2，常規(guī)SP法免疫化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后光鏡下觀察。結(jié)果分析:排除爬片邊緣細胞，低倍鏡下隨機選取1個細胞均勻分布的視野，中倍鏡下每個視野隨機選50個細胞。Caspase-3蛋白陽性細胞為胞質(zhì)著棕黃色，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3;Pi表示評分為i的比例)計算細胞HSCORE得分，以此表示Caspase-3蛋白的表達量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)處理行t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UA-PL-NP對SGC-7901細胞增殖的影響 結(jié)果顯示，UA-PL-NP對SGC-7901細胞具有增殖抑制作用，且呈劑量和時間依賴性(P均＜0.05)。見表1。UA-PL-NP 作用 24、48、72 h 的 IC50值分別為8.06、5.17、3.73 mg/L。

表1 UA-PL-NP對SGC-7901細胞增殖的影響(±s)

表1 UA-PL-NP對SGC-7901細胞增殖的影響(±s)

UA-PL-NP(mg/L)增殖抑制率(%)24 h 48 h 72 h 0.01 3.25 ±0.79* 5.71 ±0.87* 25.32 ±2.77*0.10 13.46 ±1.74* 19.11 ±2.13* 42.94 ±3.56*1.00 23.45 ±2.52* 42.62 ±3.63* 61.70 ±4.47*10.00 49.83 ±4.02* 68.54 ±4.55* 84.74 ±5.24*

2.2 UA-PL-NP對SGC-7901細胞凋亡的影響 倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞生長旺盛，呈多邊形，可見多核細胞和巨核細胞，胞膜光滑，胞質(zhì)淺藍紫色，胞核紫紅色，核仁深紫色。UA-PL-NP作用后細胞生長受抑，貼壁細胞數(shù)明顯減少，結(jié)構(gòu)模糊，細胞皺縮，密度增高，染色質(zhì)聚集，核固縮，細胞邊緣胞質(zhì)突起呈芽胞狀，從細胞主體上脫離，有的含有染色質(zhì)團塊，形成典型的凋亡小體。

2.3 UA-PL-NP對SGC-7901細胞中Caspase-3蛋白表達的影響 對照組和觀察組Caspase-3蛋白陽性表達細胞的HSCORE得分分別為(2.133±0.149)、(3.307 ±0.069)分，兩組比較，P ＜0.05。

3 討論

研究［7～10］已證實，UA 可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并且其機制可能與下調(diào)COX-2、降低Bcl-2/Bax比值、激活Caspase-3蛋白有關(guān)，也可能與抑制血管生成有關(guān)。但由于UA本身生物利用度低的缺陷，限制了其抗腫瘤等生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。UA-PL-NP的相關(guān)研究表明，其對其他惡性腫瘤細胞也有生長抑制作用。孫旭芳等［10］研究發(fā)現(xiàn)，UAPL-NP對小鼠黑色素瘤B16細胞的增殖有明顯抑制作用，并呈濃度和時間依賴性，UA-PL-NP作用24 h的IC50值為7.68 mg/L;另外，其能促進瘤細胞的凋亡，從而抑制B16小鼠黑色素瘤細胞的增殖;降低MMP-9蛋白的表達，有抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。與本實驗結(jié)果相似。

本實驗免疫細胞化學(xué)檢測顯示，UA-PL-NP可上調(diào) SGC-7901細胞 Caspase-3蛋白的表達。Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵性的作用。根據(jù)Caspase在級聯(lián)反應(yīng)上下游的位置及功能的不同，分為凋亡始動子、凋亡效應(yīng)子和炎癥組3大類。Caspase-3屬于凋亡效應(yīng)子，能被上游的始動子激活，激活后作用于特異性底物使細胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細胞凋亡。Caspase-3在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用［11］，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免，因而Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”。Caspase-3活化后大致通過酶解滅活凋亡抑制物、酶解細胞外基質(zhì)及骨架蛋白和裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子3種機制使細胞解體［12］。另外 Donepudi等［13］發(fā)現(xiàn)，Caspase-3 可導(dǎo)致細胞凋亡最終步驟的執(zhí)行。因此，UA-PL-NP可能通過上調(diào)Caspase-3表達，促進SGC-7901細胞凋亡，有望作為一種新型抗腫瘤藥應(yīng)用于臨床。

［1］Furtado RA，Rodrigues EP，Araújo FR，et al.Ursolic acid and oleanolic acid suppress preneoplastic lesions induced by 1，2-dimethylhydrazine in rat colon［J］.Toxicol Pathol，2008，36(4):576-580.

［2］Manu KA，Kuttan G.Ursolic acid induces apoptosis by activating p53 and caspase-3 gene expressions and suppressing NF-kappaB mediated activation of bcl-2 in B16F-10 melanoma cells［J］.Int Immunopharmacol，2008，8(7):973-981.

［3］Dufour D，Pichette A，Mshvildadze V，et al.Antioxidant，anti-inflammatory and anticancer actvities ofmethanolic extracts from ledum groenlandicum Retzius［J］.JEthnopharmacol，2007，11(1):22-28.

［4］You HJ，ChoiCY，Kim JY，etal.Ursolic acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production via nuclear factorkappaB activation in the resting macrophages［J］.FEBS Lett，2001，59(2):156-160.

［5］鄧啟盼，曹亞.納米脂質(zhì)體應(yīng)用于腫瘤研究的進展［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，30(6):489-494.

［6］Stathopoulos GP，Boulikas T，Vougiouka M，etal.Pharmacokinetics and adverse reactions of a new liposomal cisplatin(Lipoplatin):phase Istudy［J］.Oncol Rep，2005，13(4):589-595.

［7］Tian Z，Lin G，Zheng RX，et al.Anti-hepatoma activity and mechanism of ursolic acid and its derivatives isolated from Aralia decaisneana［J］.World JGastroenterol，2006，12(6):874-879.

［8］Yan SL，Huang CY，Wu ST，etal.Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines［J］.Toxicol In Vitro，2010，24(3):842-848.

［9］Das B，Yeger H，Tsuchida R，etal.A hypoxia-driven vascular endothelial growth factor/Flt1 autocrine loop interacts with hypoxiainducible factor-1alpha through mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway in neuroblastoma［J］.Cancer Res，2005，65(16):7267-7275.

［10］孫旭芳，姚乃成，易以木，等.熊果酸納米脂質(zhì)體微粒對小鼠黑色素瘤細胞生長的抑制作用及其機制［J］.中華實驗外科雜志，2007，24(2):242-244.

［11］Joseph EK，Levine JD.Caspase signalling in neuropathic and inflammatory pain in the rat［J］.Eur JNeurosci，2004，20(11):2896-2902.

［12］Cryns V，Yuan J.Proteases to die for［J］.Genes Dev，1998，12(11):1551-1570.

［13］DonepudiM，Mac Sweeney A，Briand C，et al.Insights into the regulatory mechanism for caspase-8 activation［J］.Mol Cell，2003，11(2):543-549.