(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001)

勃起功能障礙(ED)是男性糖尿病(DM)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是男性DM患者生活質(zhì)量降低的重要因素。據(jù)估計(jì)男性DM患者的發(fā)病率為35% ～75%，是非DM患者的3倍。目前研究認(rèn)為，糖尿病性ED(DM-ED)的形成是多因素造成的，其中NO-GC-cGMP信號(hào)通路受損和氧化應(yīng)激失衡在DM-ED的病理機(jī)制中具有重要作用。近年來(lái)，血紅素加氧酶(HO)在勃起功能中的作用備受關(guān)注［1］。一氧化碳(CO)是HO催化降解血紅素的產(chǎn)物之一，與一氧化氮(NO)有類(lèi)似的生物學(xué)活性，具有濃度依賴(lài)性舒張陰莖海綿體平滑肌的作用［2］;并且，HO表達(dá)與機(jī)體的氧化應(yīng)激水平有密切關(guān)系［3］，但關(guān)于HO與DM-ED的相關(guān)研究少見(jiàn)。2010年9月～2011年10月，我們建立DM-ED大鼠模型，觀察該模型大鼠陰莖海綿組織中HO的表達(dá)變化，探討其與DM-ED的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)、阿撲嗎啡(APO)，均為 Sigma公司產(chǎn)品;兔抗大鼠 HO-1、HO-2多克隆抗體和免疫組化染色試劑盒，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;三諾安穩(wěn)型血糖儀及配套試紙;GENE GENIUS凝膠圖像分析系統(tǒng)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組 雄性SD大鼠40只(購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量260～300 g，為同一批繁殖并與發(fā)情雌鼠交配試驗(yàn)證實(shí)具有正常的性功能。隨機(jī)取30只經(jīng)腹腔注射STZ(65 mg/kg)制作DM模型，余10只作為正常對(duì)照組(NC組)。72 h后采用斷尾取血法測(cè)定血糖，血糖 ＞16.7 mmol/L為造模成功。每周測(cè)定大鼠血糖1次，血糖＜16.7 mmol/L者剔除。大鼠自由飲食水，晝夜交替飼養(yǎng)。造模8周后，采用APO誘導(dǎo)試驗(yàn)(大鼠頸部皮下注射 APO 80μg/kg)［4］評(píng)價(jià) DM 大鼠的勃起功能，15只發(fā)生ED者為DM-ED組，12只(3只死亡)未發(fā)生ED者為單純DM組。

1.3 HO-1、HO-2的檢測(cè)方法 兩組大鼠麻醉后取陰莖海綿體組織，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋并切片，予以免疫組化SP法染色，觀察HO-1、HO-2表達(dá)部位，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色。按試劑說(shuō)明書(shū)操作，用胰酶抗原修復(fù)，室溫修復(fù)20 min，封片后光鏡下觀察并攝片。采用Western blot法檢測(cè)HO-1和HO-2表達(dá)水平:取凍存大鼠陰莖海綿體組織進(jìn)行蛋白樣品制備，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，以β-actin為內(nèi)參，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)移。常規(guī)顯影、定影，用GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)分析其灰度值，以相應(yīng)內(nèi)參灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值×100作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組中均有HO-1、HO-2表達(dá)，主要表達(dá)于海綿體平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中。各組陰莖海綿體組織中HO-1、HO-2相對(duì)表達(dá)量比較，見(jiàn)表1。

3 討論

表1 各組陰莖海綿體組織中HO-1、HO-2相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1 各組陰莖海綿體組織中HO-1、HO-2相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與NC 組比較，*P ＜0.01;與單純 DM組比較，#P ＜0.05，△P＜0.01

HO-1 HO-2 NC組組別11.38 ±1.77 27.69 ±5.07單純 DM 組 28.49 ±4.74* 16.41 ±2.75*DM-ED 組 18.02 ±3.19*# 7.04 ±2.94＊△

HO在體內(nèi)有豐富的生物學(xué)作用，且與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，多見(jiàn)于DM相關(guān)并發(fā)癥的研究中［5］，其與DM-ED關(guān)系的研究少見(jiàn)。Hedlund等［6］研究發(fā)現(xiàn)，陰莖海綿體中含有HO-1神經(jīng)纖維，陰莖血管內(nèi)皮中存在HO-1和HO-2的表達(dá)，認(rèn)為HO/CO系統(tǒng)與NOS/NO系統(tǒng)在陰莖勃起機(jī)制中一定的互補(bǔ)作用。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是DM-ED的發(fā)病機(jī)制之一［7］。高血糖狀態(tài)使陰莖海綿體局部晚期糖基化終末產(chǎn)物增加，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧(ROS)生成增多;ROS隨著DM病程的延長(zhǎng)而增加，抗氧化物的表達(dá)及活性下降，且與DM-ED的嚴(yán)重程度相關(guān)［8］。氧化應(yīng)激損傷DM大鼠血管內(nèi)皮和海綿體結(jié)構(gòu);大量的ROS與NO反應(yīng)，生成高毒性的過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO－)，降低NO的生物利用度，對(duì)組織的結(jié)構(gòu)和功能造成進(jìn)一步損害，且反饋生成更多的ROS，惡性循環(huán)最終誘導(dǎo)ED的發(fā)生。ROS還可通過(guò)其他途徑參與ED的病理機(jī)制，ROS使eNOS磷酸化受阻，降低eNOS的活性;活化Rho/Rho激酶通路，增強(qiáng)海綿體平滑肌收縮敏感性等［9］。有研究結(jié)果證明，抗氧化物還原性谷胱甘肽［10］和過(guò)氧化物歧化酶類(lèi)似物［11］可改善DM大鼠的勃起功能，也間接驗(yàn)證了氧化應(yīng)激在DM-ED發(fā)病機(jī)制中的重要性。

高血糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損害可適應(yīng)性上調(diào)HO-1的表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激造成的損傷;HO-1的表達(dá)增加常與應(yīng)激刺激有關(guān)，且對(duì)機(jī)體常起到保護(hù)作用［12］。實(shí)驗(yàn)［13］證明，上調(diào) HO-1 表達(dá)能誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，比如細(xì)胞外超氧化物歧化酶(ECSOD)和胞質(zhì)內(nèi)過(guò)氧化氫酶等，提高細(xì)胞抗氧化活性，降低氧自由基的生成;提高血管對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)，改善DM導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能損害。有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)能抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸基磷酸鹽(NADPH)氧化酶的活性，減少過(guò)氧化物的形成，減輕氧化應(yīng)激損傷。有研究［15］證實(shí)，姜黃素通過(guò)提高陰莖海綿體內(nèi)HO-1的活性、增加cGMP的含量和陰莖海綿體內(nèi)壓，調(diào)節(jié)大鼠的勃起功能。

HO-2與HO-1具有共同的生物學(xué)作用，為結(jié)構(gòu)型酶，其表達(dá)基本不被誘導(dǎo)。內(nèi)源性的CO主要由HO-2催化生成。NO/GC/cGMP信號(hào)通路在勃起功能中的作用已被公認(rèn)。CO是與NO類(lèi)似的氣體分子，在體內(nèi)有和NO相似的生物學(xué)活性，CO可通過(guò)活化鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(GC)刺激cGMP的生成，起到舒張陰莖海綿體平滑肌的作用，在勃起功能中有重要作用［8，9］。HO-2基因缺陷的動(dòng)物，DM 相關(guān)氧化應(yīng)激水平增加，對(duì)局部組織或器官結(jié)構(gòu)和功能造成損害［16］。HO-2的表達(dá)下降，使膽綠(紅)素等有抗氧化活性的內(nèi)源性物質(zhì)生成減少，氧化應(yīng)激水平失衡;且CO生成減少，陰莖海綿體平滑肌結(jié)構(gòu)受損及舒張功能受限，不利于陰莖的正常勃起。有研究［17］認(rèn)為，慢性腎衰大鼠勃起功能受損可能與陰莖海綿體中HO-2的表達(dá)降低有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HO-1、HO-2主要表達(dá)于大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中。與正常對(duì)照大鼠，單純DM大鼠和DM-ED大鼠陰莖海綿體組織中HO-1表達(dá)均增加，HO-2的表達(dá)均降低;而與單純DM大鼠相比，DM-ED大鼠HO-1、HO-2的表達(dá)均降低。我們認(rèn)為，DM大鼠在高血糖的應(yīng)激狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平增加，適應(yīng)性誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)增加，氧化應(yīng)激對(duì)平滑肌和血管內(nèi)皮的損傷使HO-2的表達(dá)降低;上調(diào)的HO-1可增強(qiáng)局部的抗氧化能力，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，單純DM大鼠HO-1代償能力較強(qiáng)，且HO-2的表達(dá)下降不明顯，能對(duì)抗氧化應(yīng)激造成的損害，維持正常的勃起功能;與單純DM大鼠相比，DM-ED大鼠HO-1的代償增加不足，HO-2表達(dá)又進(jìn)一步降低，局部抗氧化能力顯著下降;且HO表達(dá)降低導(dǎo)致CO生成減少，進(jìn)而cGMP的生成量也減少，陰莖海綿體平滑肌的結(jié)構(gòu)受損和舒張功能受限，不利于勃起機(jī)制的發(fā)生，最終形成ED。

綜上所述，DM-ED大鼠陰莖海綿體組織中HO-1表達(dá)代償不足、HO-2表達(dá)明顯下調(diào);HO-1、HO-2可能參與DM-ED的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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