張 躍,邵小青,陳 貝,季明春,龔衛(wèi)娟

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)和免疫學(xué)教研室,江蘇揚(yáng)州,225001)

MHC I類相關(guān)抗原A(MICA)是細(xì)胞受到應(yīng)激反應(yīng)后在其表面表達(dá)的一種蛋白。MICA受體為表達(dá)于 NK 、NKT 、CD8+T 、γ δ T 等細(xì)胞表面的活化性受體NKG2D。當(dāng)NKG2D與其配體結(jié)合后,主要通過與其偶聯(lián)的轉(zhuǎn)接蛋白DAP10傳遞活化信號,是介導(dǎo)細(xì)胞毒功能的關(guān)鍵蛋白[1]。近來研究[2-3]發(fā)現(xiàn),MICA具有介導(dǎo)NK細(xì)胞與DC之間相互作用的活性,MICA陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞易被NK細(xì)胞攻擊而進(jìn)入凋亡狀態(tài)。因此,本文試圖觀察腫瘤細(xì)胞過表達(dá)MICA抗原時(shí),被誘導(dǎo)形成的凋亡小體對DC吞噬活性的影響。該研究將深入揭示使用某些化學(xué)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或上調(diào)MICA抗原表達(dá)時(shí),不僅直接影響天然免疫功能,且因具有調(diào)節(jié)DC的活性繼而對獲得性免疫功能產(chǎn)生影響[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組pcDNA3.1-MICA表達(dá)載體由本室自行構(gòu)建并保存[4],紅白血病細(xì)胞株K562,單核細(xì)胞株THP1均來自美國ATCC,由本室常規(guī)保存。外周血淋巴細(xì)胞分離液購自挪威Axis-shield公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。胎牛血清購自杭州四季青公司,G418、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B購自上海生工生物公司。絲裂霉素C來自Sigma公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine 2000購自 Invitrogen公司。重組人GM-CSF、IL-4購自 PeproTech公司。FITC-抗-CD14mAb,APC-抗-CD11cmAb,PE-抗-MICA mAb,PE-抗-HLA-DR mAb,PE-Cy5-抗-CD86 mAb,PE-抗-NKG2D mAb,NKG2D中和性抗體均購自Biolegend或eBioscience公司。CFSE細(xì)胞染色試劑盒來自 Invitrogen公司。流式細(xì)胞儀FACS Arial來自Becton Dickinson公司。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)MICA抗原的K562細(xì)胞株的建立

無菌條件下抽提質(zhì)粒,按照Invitrogen公司的說明書進(jìn)行操作,具體過程為:取對數(shù)期的K562細(xì)胞置于24孔內(nèi),共10孔。取 16 μ g的質(zhì)粒用質(zhì)粒稀釋液稀釋至總量400 μ L,取32 μ L的脂質(zhì)體用無血清培養(yǎng)基稀釋至總量400 μ L,2者混合,室溫孵育10 min,每孔加入100 μ L的復(fù)合物,另外兩孔作為陰性對照。37℃,5%CO2培養(yǎng)4 h后加入全培養(yǎng)基,48 h后加入G418篩選。2周后篩選出G418抗性的細(xì)胞。對篩選出的細(xì)胞用PE-MICA抗體標(biāo)記,進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分選,得到純度>90%的K562-MICA細(xì)胞。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP1細(xì)胞的表型

分別取對數(shù)期培養(yǎng)的K562和K562-MICA細(xì)胞,用絲裂霉素 C(30 μ g/mL)37 ℃處理3 h,全培養(yǎng)基洗滌3遍。按1︰1比例與THP1細(xì)胞孵育過夜。收集混合培養(yǎng)的細(xì)胞,分別標(biāo)記CD14和CD86、MICA、HLA-DR 和NKG2D 的抗體,流式細(xì)胞儀分析CD14陽性細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞表面分子的表達(dá)。

1.4 DC的體外誘導(dǎo)

常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBCs),計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞的密度為2×106/mL。將細(xì)胞鋪于24孔板中培養(yǎng)(每孔500 μ L,約 1×106個(gè)細(xì)胞/孔),37℃,50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日去掉未貼壁的細(xì)胞,加新鮮培養(yǎng)基,并加細(xì)胞因子GM-CSF(100 ng/mL)和IL-4(40 ng/mL)繼續(xù)CO2培養(yǎng)。隔日半量換液,培養(yǎng)5 d,誘導(dǎo)為未成熟DC。

1.5 DC對腫瘤細(xì)胞凋亡小體的吞噬

分別取對數(shù)期培養(yǎng)的K562、K562-MICA細(xì)胞株,懸浮于1 μ L 5 mmol/L的CFSE,37 ℃孵育10 min,5倍體積全培養(yǎng)基洗滌終止反應(yīng)。CFSE標(biāo)記的細(xì)胞用絲裂霉素C(10、30 μ g/mL)處理37℃孵育3 h后,經(jīng)全培養(yǎng)基洗滌后與未成熟DC按3∶1比例孵育過夜。次日混合細(xì)胞懸液用CD11c抗體或HLA-DR抗體標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測CD11c+CFSE+細(xì)胞或 HLA-DR+CFSE+細(xì)胞,計(jì)算CD11c+CFSE+細(xì)胞或HLA-DR+CFSE+細(xì)胞頻率占總CFSE陽性細(xì)胞的頻率,(Q2/Q1+Q2)×100%代表吞噬率。

2 結(jié) 果

2.1 K562-MICA細(xì)胞的鑒定

K562-MICA細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),說明MICA抗原已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)在K562細(xì)胞表面(圖1)。

2.2 凋亡的K562-MICA細(xì)胞對THP1細(xì)胞相關(guān)表型的影響

在確定 THP1表達(dá)CD14和CD11c細(xì)胞表面標(biāo)記的基礎(chǔ)上(圖2),觀察THP1細(xì)胞表面CD86、MICA、HLA-DR、NKG2D 表達(dá)的變化。結(jié)果顯示,K562細(xì)胞刺激可微弱上調(diào) CD86、MICA、HLA-DR和NKG2D的表達(dá)。但與K562相比,K562-MICA細(xì)胞可刺激THP1上調(diào)CD86、MICA的表達(dá),且CD86和MICA陽性的細(xì)胞頻率近2倍增長,而對HLA-DR、NKG2D的表達(dá)無明顯影響(圖3)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測MIC A在K562細(xì)胞的表達(dá)

圖2 THP1細(xì)胞高表達(dá)CD14和CD11c

圖3 K562-MICA細(xì)胞刺激THP1上調(diào)表達(dá) CD86和 MICA

2.3 K562-MICA細(xì)胞的凋亡小體對THP1細(xì)胞吞噬功能的影響

本實(shí)驗(yàn)首先將K562、K562-MICA細(xì)胞經(jīng)熒光素CFSE標(biāo)記,進(jìn)而用絲裂霉素C處理誘導(dǎo)凋亡,2者混合過夜后檢測CD11c+CFSE+細(xì)胞的頻率代表THP1細(xì)胞對凋亡小體的吞噬活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),來自 K562-MICA的凋亡小體更容易被THP1細(xì)胞吞噬(圖4)。

2.4 來自K562-MICA細(xì)胞的凋亡小體對DC吞噬功能的影響

與K562細(xì)胞相比,來自K562-MICA細(xì)胞的凋亡小體更容易被 DC吞噬,且 DC內(nèi)吞噬的CFSE碎片熒光強(qiáng)度降低,提示這些碎片進(jìn)入DC胞漿內(nèi)已被及時(shí)加工處理[6](圖5)。

圖4 來自K562-MICA的凋亡小體促進(jìn)THP1細(xì)胞吞噬

圖5 來自K562-MIC A細(xì)胞的凋亡小體易被DC吞噬

2.5 DC對K562-MICA細(xì)胞凋亡小體的吞噬依賴NKG2D受體

盡管凋亡狀態(tài)的K562細(xì)胞可上調(diào)DC表達(dá)NKG2D受體,但MICA在K562細(xì)胞表達(dá)后可協(xié)同刺激NKG2D的上調(diào)表達(dá),尤其在細(xì)胞凋亡程度(絲裂霉素C 30 μ g/mL)較為明顯時(shí),MICA 的協(xié)同作用亦較為明顯(圖6)。在此基礎(chǔ)上,作者在DC與凋亡細(xì)胞的懸液中加入人NKG2D的中和性抗體,結(jié)果顯示,NKG2D抗體可拮抗DC對K562-MICA細(xì)胞凋亡小體的吞噬作用(P<0.05),但并未下降到對K562細(xì)胞的水平,提示DC表面可能還有其他受體參與吞噬作用[7](圖7)。

圖6 K562-MICA細(xì)胞刺激DC上調(diào)表達(dá)NKG2D受體

圖7 NKG2D抗體拮抗DC對K562-MICA細(xì)胞凋亡小體的吞噬活性

3 討 論

本研究初步揭示了某些化學(xué)藥物(如柔紅霉素、硼替佐米等)治療腫瘤的分子機(jī)制,因?yàn)檫@些藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞表面表達(dá)MICA抗原。DC吞噬腫瘤細(xì)胞凋亡小體的意義不僅僅在于清除細(xì)胞碎片,更重要的是將腫瘤細(xì)胞來源的特異性抗原遞呈給T細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫記憶的產(chǎn)生,從而達(dá)到根治腫瘤的目的。

NKG2D的配體除MICA抗原,還包括MICB和ULBP1～6分子。小鼠NKG2D還可識別視黃酸早期誘導(dǎo)蛋白-1(RAE-1),次要組織相容性抗原(H60)和鼠ULBP樣轉(zhuǎn)錄子(MULT-1)?；贜KG2D配體表達(dá)譜的研究已證實(shí),80%的上皮性腫瘤細(xì)胞表達(dá)MICA,而血液細(xì)胞來源腫瘤表達(dá)NKG2D的另一配體(ULBP)。然而由于免疫選擇的壓力(即免疫細(xì)胞清除MICA抗原高表達(dá)的細(xì)胞),晚期腫瘤細(xì)胞表面MICA表達(dá)往往逐漸降低或丟失,造成免疫細(xì)胞不能識別腫瘤[8]。因此,通過某些化療藥物或基于MICA高表達(dá)的基因疫苗來提高腫瘤細(xì)胞表達(dá)MICA的密度,可作為腫瘤免疫治療的手段之一。

K562-MICA細(xì)胞來源的凋亡小體可明顯促進(jìn)DC表達(dá)NKG2D,而THP1細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)卻沒有明顯變化。作者推測一方面可能與兩種細(xì)胞處于分化的不同階段有關(guān),THP1處于早期的單核細(xì)胞階段;另一方面,THP1為發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞,與機(jī)體內(nèi)正常細(xì)胞的生物學(xué)特征不完全一致。NKG2D一直被認(rèn)為僅表達(dá)于淋巴細(xì)胞,但最近研究發(fā)現(xiàn),DC或巨噬細(xì)胞在某些條件下可表達(dá)NKG2D。Baba等[9]報(bào)道大鼠體內(nèi)CD4+CD8+巨噬細(xì)胞可表達(dá)NKG2D,通過識別腫瘤細(xì)胞表面MICA抗原而發(fā)揮抗腫瘤活性。Buhtoiarov等[10]發(fā)現(xiàn)小鼠初始巨噬細(xì)胞與L5178Y淋巴瘤細(xì)胞株及內(nèi)毒素(LPS)共孵育后上調(diào)NKG2D受體的表達(dá)。K562-MICA細(xì)胞促進(jìn)DC上調(diào)NKG2D表達(dá)的機(jī)制,推測可能與凋亡小體表面的危險(xiǎn)信號(包括MICA抗原)分別與DC表面相關(guān)受體(如清道夫受體、DEC-205、TLR、NKG2D)結(jié)合,誘導(dǎo)DC活化有關(guān)。但在誘導(dǎo)NKG2D表達(dá)的刺激信號中,哪一種信號發(fā)揮關(guān)鍵作用,仍然需要深入研究。

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