郝鳳奇，李景梅*，楊桂連

(1.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

乳酸菌作為人和動物消化道內(nèi)的正常菌群，被公認(rèn)為“安全級”的微生物[1]。構(gòu)建乳酸菌質(zhì)粒表達(dá)載體對于制備功能性重組乳酸菌至關(guān)重要。Nisin為由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌的一種小分子抗生物肽，由34個氨基酸組成，分子量約為3.5 ku，能夠抑制多數(shù)食品腐敗菌的生長，對人和動物無害，是一種高效、無毒的天然食品防腐劑[2]。Nisin生物合成的基因簇包括：nisABTCIPRKFEG，nisR與nisK構(gòu)成雙組分調(diào)控元件。Nisin的合成遵循密度感受原理，首先，nisR的組成型啟動子持續(xù)啟動nisK表達(dá)組氨酸激酶(NisK)，同時nisR自身編碼應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(NisR)；其次，NisK為膜結(jié)合感應(yīng)蛋白，其N末端位于細(xì)胞外，可在少量Nisin存在時，發(fā)生自身磷酸化，并將磷酸基團(tuán)傳遞給細(xì)胞內(nèi)的NisR；最后，磷酸化被激活的NisR可作為轉(zhuǎn)錄激活物啟動下游誘導(dǎo)型啟動子nisA/nisF的基因表達(dá)。

本研究將Nisin生物合成的雙組份調(diào)控元件nis-RK基因亞克隆至pW425et中，并以誘導(dǎo)型啟動子nisA基因替換基礎(chǔ)質(zhì)粒中的組成型啟動子P32，構(gòu)建乳酸菌Nisin誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒載體pW425N，以gfp作為報告基因，檢測載體的誘導(dǎo)表達(dá)功能。研究結(jié)果為功能性重組乳酸菌的制備和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 分泌型基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et、含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒pGEM-T-gfp由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)王春鳳教授惠贈；pGEM-T-nisRK由本研究室構(gòu)建[3]；豬源嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)分離自仔豬腸道，產(chǎn)NisinL.lactis分離自牛乳，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物微生態(tài)學(xué)研究室保存；pMD18-T購自TaKaRa公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；染色體提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒購自Axygen公司；Nisin購自Sigma公司。

1.3 nisA和gfp基因的克隆與序列分析 根據(jù)GenBank登錄的nisA(AF465351.1)和gfp(U76561.1)基因序列，結(jié)合基礎(chǔ)載體的酶切位點設(shè)計引物，由TaKaRa公司合成。nisA上、下游引物分別為：5'-GGGGAATTCATTAAATTCTGAAGT-3'(EcoRⅠ)、5'-GGGGGATCCTTATTTGCTTACGTG-3'(BamHⅠ)，gfp上、下游引物分別為：5'-GTTCCGCGGATGACC ATGATTACG-3'(SacⅡ)、5'-GGGATCGATTTATTT GTAGAGCTC-3'(ClaⅠ)。提取L.lactis染色體，并以其為模板，PCR擴(kuò)增nisA基因。以pGEM-T-gfp為模板擴(kuò)增gfp基因?；厥占兓康幕?，與克隆載體連接，分別構(gòu)建pMD18-nisA和pMD18-gfp，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，篩選陽性重組體進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果采用Blast軟件比對序列相似性。

1.4 nisRK基因穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用XbaⅠ和KpnⅠ分別對pGEM-T-nisRK和pW425et進(jìn)行雙酶切，試劑盒回收nisRK基因和pW425et大片段，T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，以紅霉素篩選陽性重組質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定陽性重組質(zhì)粒pW425et-nisRK。

1.5 誘導(dǎo)型啟動子nisA替換組成型啟動子P32采用EcoRⅠ和BamHⅠ分別對pMD18-nisA和pW425et-nisRK進(jìn)行雙酶切，試劑盒回收nisA基因和pW425et-nisRK大片段(已通過EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切去除組成型啟動子P32)，T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，以紅霉素篩選陽性重組質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，并命名為pW425N。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 采用SacⅡ和ClaⅠ分別對pMD18-gfp和pW425N進(jìn)行酶切，試劑盒回收gfp基因和pW425N載體，T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pW425N-gfp，并電轉(zhuǎn)化L.acidophilus受體菌。

L.acidophilus感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[4]和[5]方法并作適當(dāng)修改。挑取豬源L.acidophilus菌落接種于新鮮的10 mL MRS液體培養(yǎng)基中(含1%Gly)，37℃厭氧靜止培養(yǎng)至菌體OD600nm值為0.6～0.8。按1%～2%劑量接種于新鮮MRS液體培養(yǎng)基(含1%Gly)，37℃厭氧靜止培養(yǎng)，待菌體OD600nm值為0.2～0.3時，收集菌體培養(yǎng)物冰浴10 min，4℃6000 r/min離心5 min。沉淀以冰冷的清洗緩沖液(1.16 mmol/L Na3PO4、0.09 mmol/L MgCl2)清洗2次；4℃6000 r/min離心5 min收集沉淀，重懸于電擊緩沖液(0.19 mol/L Sucrose、0.3 mmol/L MgCl2)中，冰浴5 min。取200 μL感受態(tài)，加入20 μL重組質(zhì)粒pW425N-gfp，混合后于預(yù)冷的電極杯中(Φ20 mm)，冰浴5 min后進(jìn)行高壓電轉(zhuǎn)化。冰浴5 min，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)至800 μL新鮮的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜止復(fù)蘇4 h～5 h，涂布含有紅霉素(400 μg/mL)的 MRS平板，37℃厭氧靜止培養(yǎng) 16 h～20 h，篩選陽性重組菌擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒采用酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.7 gfp基因在L.acidophilus中的誘導(dǎo)表達(dá)

1.7.1 豬源L.acidophilus對Nisin耐受濃度(RC)和最小抑菌濃度(MIC)的確定 挑取豬源L.acidophilus單個菌落接種于新鮮MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，取菌液按1∶100比例分別接種于含有不同有效濃度Nisin(10 ng/mL～60 ng/mL)的MRS培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)過夜后測定菌液OD600nm值，確定受體菌對Nisin的RC和MIC。

1.7.2 Nisin對gfp基因誘導(dǎo)表達(dá)時間的確定 將陽性重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus接種于MRS培養(yǎng)基中(紅霉素400 μg/mL)，37℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，添加有效濃度為10 ng/mL的Nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液OD600nm值為0.6～0.8時，記為誘導(dǎo)0 h，添加Nisin后，每隔1 h取菌液，至7 h；將收集的菌液用液體MRS培養(yǎng)基調(diào)OD600nm值為0.6～0.8，4℃ 4000 r/min離心10 min，沉淀用無菌生理鹽水清洗3次，重懸于生理鹽水中。采用熒光分光光度計在激發(fā)光OD460nm波長下測定樣品OD509nm波長下的相對熒光強(qiáng)度，以確定最適誘導(dǎo)表達(dá)時間。

1.7.3 gfp基因誘導(dǎo)表達(dá)所需Nisin的最佳有效濃度的確定 將陽性pW425N-gfp/L.acidophilus接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，向培養(yǎng)基中添加Nisin，使有效濃度分別為10 ng/mL～60 ng/mL；誘導(dǎo)表達(dá)后，分別取不同組樣品，測定收集菌液的相對熒光強(qiáng)度。同時，取重組菌菌液100 μL，10倍稀釋后分別進(jìn)行革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5 Demo進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 nisA基因和gfp基因的PCR擴(kuò)增 以提取的L.lactis染色體為模板，PCR擴(kuò)增nisA基因，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相符(251 bp)。以pGEM-T-gfp為模板，擴(kuò)增gfp基因，擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相符(792 bp)。序列測定結(jié)果表明，擴(kuò)增的目的基因與模板序列(AF465351.1和U76561.1)相似性為100%。

2.2 表達(dá)載體pW425N的鑒定 基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et大小為4.8 kb，nisRK基因大小為2.0 kb，重組載體pW425et-nisRK采用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切，分別在4.8 kb和2.0 kb處可見清晰條帶；誘導(dǎo)型啟動子nisA為251 bp，重組載體pW425et-nisRK原組成型啟動子為113 bp，替換啟動子后，大小為6.9 kb，以替換前后的載體為模板進(jìn)行PCR鑒定，pW425N為模板的泳道在251 bp處可見清晰條帶，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pW425N，分別在6.7 kb和251 bp處可見清晰條帶(圖1)。結(jié)果表明構(gòu)建了乳酸菌Nisin誘導(dǎo)表達(dá)載體pW425N(圖2)。將pW425N和gfp基因的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化豬源L.acidophilus，篩選陽性重組菌，提取質(zhì)粒，用SacⅡ和ClaⅠ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果在約6.9 kb和792 bp處分別出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)，表明構(gòu)建了重組表達(dá)載體pW425N-gfp。

圖1 乳酸菌Nisin誘導(dǎo)表達(dá)載體pW425N的鑒定Fig.1 Identification of pW425N by restriction enzyme digestions

圖2 pW425N載體圖譜Fig.2 Map of pW425N

2.3 豬源L.acidophilus對Nisin的RC和MIC 將受體菌L.acidophilus接種于含有不同濃度Nisin的液體MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后測定菌液OD600nm值，結(jié)果表明，RC為40 ng/mL，MIC為60 ng/mL(圖4)。此外，當(dāng)Nisin有效濃度為10 ng/mL時，受體菌仍然生長良好，因此，以該濃度為標(biāo)準(zhǔn)對gfp基因誘導(dǎo)表達(dá)時間進(jìn)行測定。

圖3 重組載體pW425N-gfp酶切鑒定Fig.3 Identification of pW425N-gfp by digested with enzyme

圖4 豬源L.acidophilus對Nisin的敏感濃度Fig.4 Sensitive concentration ofL.acidophilusfor Nisin

2.4 Nisin對gfp基因的誘導(dǎo)表達(dá)時間 以有效濃度為10 ng/mL的Nisin為誘導(dǎo)物，對gfp基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，非誘導(dǎo)條件下未見綠色熒光，而誘導(dǎo)3 h時綠色熒光蛋白的相對熒光強(qiáng)度達(dá)最高值，為341.7±0.20。

2.5 gfp基因誘導(dǎo)表達(dá)所需Nisin的最佳濃度 重組菌 pW425N-gfp/L.acidophilu生長至 OD600nm值為0.6～0.8時，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的Nisin，誘導(dǎo)3 h后，測定不同濃度下菌液的相對熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，Nisin的有效濃度為30 ng/mL時綠色熒光蛋白的相對熒光強(qiáng)度達(dá)最高值588.5±0.16。

2.6 重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus表達(dá)GFP的觀察 添加30 ng/mL的Nisin對pW425N-gfp/L.acidophilus誘導(dǎo)3 h后，取菌液100 μL，10倍稀釋后進(jìn)行革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察，并以不含gfp基因的重組菌pW425N/L.acidophilus做陰性對照。結(jié)果表明，重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖5)。

3 討論

圖5 革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察(1000×)Fig.5 Observation by recombinant bacteria by Gram staining and fluorescence microscope(1000×)

啟動子P32為組成型啟動子，是從乳脂鏈球菌中克隆得到，包括開放閱讀框和一個能被E.coli、枯草芽孢桿菌和乳鏈球菌識別的核糖體結(jié)合位點。pMG36e是首個利用啟動子P32構(gòu)建的乳酸菌組成型表達(dá)載體，應(yīng)用該載體已表達(dá)了溶菌酶、苯丙氨酸酶、枯草桿菌中性蛋白酶、超氧化物岐化酶，以及幽門螺旋桿菌熱休克蛋白A、黏附素Hp0410等抗原蛋白[6-8]。本研究所采用的基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et[9]中含有P32組成型啟動子，利用該載體表達(dá)豬A組輪狀病毒VP4、VP7保護(hù)性抗原蛋白、新城疫病毒F保護(hù)性抗原蛋白和雞白痢沙門氏菌外膜蛋白C等[10-13]，為功能性重組乳酸菌的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建了Nisin誘導(dǎo)型表達(dá)載體pW425N。前期工作表明nisRK基因為部分重疊基因，其中的nisR啟動子是一個較強(qiáng)的啟動子[3]。本研究將nisRK基因整合至pW425et中，并在擴(kuò)增誘導(dǎo)型啟動子nisA基因時，在上下游引物分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，完成啟動子的替換，并且擴(kuò)增的nisA基因包括啟動子的必須功能區(qū)，即-35區(qū)(ATTAAT)，1 bp～7 bp；-10 區(qū)(TACAAT)，24 bp～29 bp；核糖體結(jié)合位點(TAAGGAGG)，67 bp～74 bp。

Nisin是一種抗生物肽，執(zhí)行誘導(dǎo)前須確定受體菌L.acidophilus對Nisin的RC和MIC，試驗結(jié)果顯示，最高誘導(dǎo)濃度應(yīng)低于60 ng/mL，而當(dāng)Nisin有效濃度為10 ng/mL時，GFP的相對熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在誘導(dǎo)后的3 h，并且表明載體受控嚴(yán)格，與Kuipers等研究結(jié)論相符[14]；誘導(dǎo)1 h～3 h，GFP的相對熒光強(qiáng)度與誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)，盡管誘導(dǎo)3 h GFP的相對熒光強(qiáng)度出現(xiàn)最大值，但誘導(dǎo)1 h的增加幅度最大，推測可能是與重組蛋白質(zhì)的“代償表達(dá)”有關(guān)，有必要進(jìn)行深入研究。另外，在誘導(dǎo)3 h的條件下，Nisin的最佳有效濃度為30 ng/mL，并且在該濃度以前，GFP的相對熒光強(qiáng)度與Nisin的有效濃度呈現(xiàn)明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，與Willem提出的觀點一致[15]。此外，當(dāng)Nisin有效濃度大于30 ng/mL時，結(jié)果正相反，可能是因添加的Nisin大于RC導(dǎo)致菌體生長緩慢，GFP表達(dá)水平呈下降趨勢，以至于當(dāng)濃度為60 ng/mL時(MIC)，幾乎檢測不到相對熒光強(qiáng)度。

本研究依據(jù)Nisin生物合成的密度感受原理，以乳酸菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pW425et為基礎(chǔ)質(zhì)粒，構(gòu)建乳酸菌Nisin誘導(dǎo)表達(dá)載體pW425N，該載體受控嚴(yán)格，表達(dá)產(chǎn)物與誘導(dǎo)物之間在一定范圍內(nèi)存在“劑量-效應(yīng)關(guān)系”，為同源或異源功能性蛋白質(zhì)在乳酸菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和功能性重組乳酸菌制劑的研制提供了可操作的技術(shù)平臺。

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