蔣 偉，袁遠(yuǎn)華，廖曉鴻，蘇丹萍，賀東生

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)，無(wú)囊膜，直徑約17 nm，是最小的動(dòng)物病毒之一。PCV2感染以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)最為常見(jiàn)。主要感染7周齡～15周齡仔豬，僅有一例感染3周齡新生仔豬的報(bào)道[1]，臨床癥狀表現(xiàn)為消瘦、呼吸困難、腹瀉、可視黏膜蒼白，也會(huì)伴發(fā)皮炎，剖檢可見(jiàn)淋巴結(jié)腫脹，腎損傷，死亡率較高[2]。

PCV2基因組為一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)為1768 bp或1767 bp。有3個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(ORF)，ORF1最大，編碼病毒的復(fù)制蛋白；ORF2是PCV2的重要抗原基因，編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白(Cap蛋白)，與宿主免疫有關(guān)，是構(gòu)建重組疫苗和建立檢測(cè)方法的首選基因。近年來(lái)ORF3基因成為PCV2疫苗研究的熱點(diǎn)，Anbu等對(duì)天然宿主豬接種了缺失ORF3基因的PCV2，結(jié)果表明該變異病毒株會(huì)導(dǎo)致溫和的并且不出現(xiàn)病理?yè)p傷的病毒血癥[3]。此研究提示ORF3基因在PCV2對(duì)宿主致病性方面的重要作用。

疫苗接種是預(yù)防和控制圓環(huán)病毒病最有效的辦法，本實(shí)驗(yàn)將PCV2的抗原表位串聯(lián)并在大腸桿菌表達(dá)，為PCV2基因工程亞單位苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、DNA片段純化試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；原核表達(dá)載體pET32a(+)和兔抗PCV2陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；蛋白純化試劑盒6×His-Tagged Protein Purification KitNi-Agarose His購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCV2 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自廣州展晨生物科技有限公司。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCV2的ORF2中aa 156～aa 162、aa 175～aa 192、aa 195～aa 202、aa 231～aa 233和ORF3中aa 31～aa 50串聯(lián)構(gòu)成一個(gè)連續(xù)的閱讀框，人工合成編碼該融合蛋白的DNA，基因密碼子的選擇兼顧大腸桿菌的偏愛(ài)性，并在DNA序列的兩端加上EcoRⅤ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，DNA全長(zhǎng)180 bp由上海Invitrogen有限公司合成，新基因命名為HJW，其DNA序列所編碼的氨基酸序列見(jiàn)表1。將HJW連接至pMD18-T中，將重組質(zhì)粒及pET32a(+)進(jìn)行EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切并連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HJW(圖1)。

1.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-HJW轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑菌培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h，取菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

1.4 重組蛋白的純化和濃度測(cè)定 一部分菌液用于分析總蛋白，另一部分用于提取包涵體蛋白。在純化的包涵體中加入8 mol/L尿素，冰上1 h，使蛋白質(zhì)充分溶解變性，5000 r/min離心后取上清液，上清采用Ni-NTA樹(shù)脂化，具體方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。重組蛋白經(jīng)純化后，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，確定純化后重組蛋白的濃度，計(jì)算重組蛋白的表達(dá)量。

表1 HJW的氨基酸序列Table 1 The amino acids sequences of HJW

圖1 pET32a(+)-HJW的構(gòu)建Fig.1 Construction of pET32a(+)-HJW

1.5 重組蛋白反應(yīng)原性分析

1.5.1 Western blot鑒定 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，以 1∶2000倍稀釋的PCV2陽(yáng)性兔多抗血清為一抗，以1∶1500倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行western blot，室溫孵育30 min，DAB溶液顯色。

1.5.2 間接ELISA 將重組蛋白稀釋至工作濃度，4℃過(guò)夜，加入封閉液37℃封閉30 min。另取ELISA試劑盒抗原包被板4孔陰陽(yáng)性對(duì)照各兩孔，加入陰、陽(yáng)性血清，37℃結(jié)合45 min。每孔加入100 μL工作濃度的酶標(biāo)記抗體，37℃結(jié)合30 min。每孔先后加入底物A液和底物B液，密封37℃避光作用 10 min，加入終止液，10 min內(nèi)測(cè)定OD630nm值。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照OD630nm值≥0.7、陰性對(duì)照OD630nm值<0.3時(shí)試驗(yàn)條件成立，此時(shí)如被檢樣品OD630nm值>0.42即判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 pET-HJW的構(gòu)建 從重組菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)電泳、PCR、酶切、測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果表明目的片段已插入載體中(圖2)，并且讀碼框正確。

圖2 pET-HJW基因雙酶切電泳圖Fig.2 Restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白表達(dá)、純化及鑒定 SDS-PAGE結(jié)果顯示，pET-HJW轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白獲得表達(dá)，分子質(zhì)量與預(yù)期相符(圖3)。包涵體溶解液溶解后經(jīng)Ni親和柱純化，分別用不同濃度咪唑洗脫后收集各組分，對(duì)純化的包涵體透析復(fù)性后離心收集上清與沉淀。

圖3 表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant prtotein expression

2.3 重組蛋白濃度測(cè)定 PCV2 ORF2基因中存在大腸桿菌稀有密碼子，尤其是在ORF2基因編碼的N端有41個(gè)氨基酸為核定位信號(hào)，但不包含主要的抗原區(qū)域，而且N端存在大量大腸桿菌的稀有密碼子(約占30%)，并以串聯(lián)形式存在，這將會(huì)嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)密碼子優(yōu)化，經(jīng)檢測(cè)表達(dá)后的重組蛋白濃度達(dá)到206.2 mg/L，表明重組蛋白得到了高效的表達(dá)。

2.4 重組蛋白western blot檢測(cè) 重組蛋白經(jīng)western blot檢測(cè)，出現(xiàn)一條特異性條帶，約為27 ku(圖4)，表明該重組蛋白能夠被PCV2滅活兔血清特異性識(shí)別。

圖4 重組蛋白western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein

2.5 間接ELISA鑒定 酶標(biāo)儀讀數(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組OD630nm值為0.465>0.42，表明重組蛋白具有反應(yīng)原性。Shang等利用PCV2衣殼蛋白單克隆抗體(MAb)將PCV2的抗原表位精確地定位于ORF2基因所編碼氨基酸的156～162位、175～192位、195～202位和231～233位[5]。Stevenson等采用MAb和抗原表位分析，證明T淋巴細(xì)胞與PCV2的免疫反應(yīng)主要取決于ORF3(氨基酸殘基31～50位)和ORF1(氨基酸殘基81～100位和201～220位)非結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位[6]。通過(guò)反應(yīng)原性分析，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與其相符。

國(guó)外針對(duì)PCV2疫苗的研究已取得重要進(jìn)展，但因其價(jià)格昂貴而不能在集約化豬場(chǎng)普及使用。本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，不僅操作簡(jiǎn)單，而且其表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，表達(dá)量也比其他表達(dá)方式高，因此利用大腸桿菌表達(dá)PCV2抗原蛋白作為基因工程亞單位疫苗的可行性較高。這將為PCV2的疫苗研制、診斷抗原和防控提供有價(jià)值的參考。

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[5]Shang Shao-bin,Jin Yu-lan,Jiang Xue-tao,et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus,and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2[J].Mol Immunol,2009,46:327-334.

[6]Stevenson L S,Glipi D F,Douglas A,et at.T lymphocyte epitope mapping of porcine circovirus type 2[J].Viral Immunol,2007,20(3):386-397.