馬紅麗 楊 波 王志紅 贠中橋

臨床上胎兒血型產(chǎn)前早期確定能夠預(yù)測母嬰血型不合妊娠的胎兒/新生兒溶血性疾?。?，2］。我們利用PCR-RFLP技術(shù)建立從O型孕婦外周血中提取DNA檢測胎兒血型的實驗方法并用該法對139例O型孕婦外周血進行檢測以研究該法檢測胎兒血型的準(zhǔn)確度。

資料與方法

1.臨床資料:選擇2009年01月～2011年07月來自洛陽市婦女兒童醫(yī)療保健中心、河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院、洛陽市中心醫(yī)院、河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院、河南科技大學(xué)第三附屬醫(yī)院等多家醫(yī)療機構(gòu)的孕婦139例，年齡23～42歲，懷孕期為13～32周期間，孕婦血型為O型，其丈夫血型為A型、B型或AB型。

2.試劑與儀器:DNA提取試劑盒(德國，QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen)，AluⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶(TaKa-Ra寶生物工程有限公司)，Taq DNA Polymerase、dNTPs(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，標(biāo)準(zhǔn)抗 A抗 B由長春生物制品公司生產(chǎn)，Marker(TaKaRa寶生物工程有限公司)。美國 PE公司生產(chǎn)的PE9700 PCR儀，Eppendorf AG Mini離心機，北醫(yī)LDZ5-2臺式低速自動平衡離心機，日本賀力士2420型號臺式冷凍高速離心機，德國XKP6-A簡潔型恒溫混勻儀，蛋白質(zhì)核酸含量測定儀，美國伯樂100/5電泳儀，美國BIO-RAD公司Gel 100凝膠成像系統(tǒng)。

3.方法:(1)DNA提取 :按血樣DNA提取試劑盒說明書中血液或體液DNA提取方案“Blood and Body Fluid Spin Protocol”提取孕婦外周血 DNA［3］。(2)目的片段擴增:參照Yamamoto等［4］和 Lee等［5］的文獻進行引物設(shè)計，序列如下:F1:5'-GTCTACCCCCAGCCAAAGGTGC-3';F2:5'-AGTGCTTCTCCGCCGTCTCCA-3';F3:5'-GACTTCTGCGAGCGGCGCT-3';F4:5'-TAGGCCTGGGACTGGGGCC-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl:10×Buffer 2.5μl;(添加濃度)MgCl21.5μl;(添加濃度)dNTPs 2.0μl;引物各 3μl;模板 2μl;Taq 酶 1μl;ddH2O 10μl。以 F1、F2為引物進行 PCR反應(yīng)的條件如下:95℃5min;95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，35 個循環(huán);72℃7min;產(chǎn)物為1896bp的片段。以F3、F4為引物進行PCR反應(yīng)的條件如下:95℃5min;95℃45s，54℃40s，72℃30s，35 個循環(huán);72℃7min;產(chǎn)物長度為185bp。(3)酶切分析:用KpnⅠ酶切F1和F2的擴增產(chǎn)物，用AluⅠ酶切F3和F4的擴增產(chǎn)物。酶切反應(yīng)體系為10μl:10 ×buffer 2μl;酶1μl;0.1%BSA 2μl;去離子水5μl，反應(yīng)條件為37℃90min。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，判斷胎兒血型。(4)新生兒血型檢測:胎兒出生后抽取臍帶血用血清學(xué)方法檢測新生兒血型［6］。(5)計算孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與新生兒血清學(xué)血型檢測的符合率。

結(jié) 果

出生前孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與出生后檢測新生兒血型相一致的病例有131例，胎兒期DNA檢測血型與新生兒出生后檢測血型不相符的有8例。出生前后血型檢測符合率為94.24%。通過孕中期孕婦DNA檢測胎兒血型與新生兒出生后血型檢測的符合率為91.95%(80/87)，通過孕晚期孕婦DNA檢測胎兒血型與新生兒出生后血型檢測的符合率為98.08%(51/52)，隨著妊娠月份的增加新生兒出生前后血型檢測的符合率逐漸增加(表1)。

表1 139例O型孕婦外周血DNA檢測胎兒血型與出生后新生兒血型符合率比較

討 論

ABO血型不合引起的新生兒溶血病(HDN)是由于胎兒和母親的血型不合所致，而大多數(shù)發(fā)生于O型孕婦所生的A型和B型嬰兒，因此，診斷對胎兒血型進行產(chǎn)前檢測可以確定該胎兒在出生時是否有患新生兒溶血病的可能，可為新生兒溶血病的預(yù)防提供可靠依據(jù)［7］。如果檢測胎兒血型為非O型，為了預(yù)防HDN的發(fā)生，我們將對該孕婦進行預(yù)防性治療，如果檢測胎兒血型為O型，將不會發(fā)生HDN，不必給予治療，從而避免了孕婦及其家庭不必要的經(jīng)濟負擔(dān)和精神負擔(dān)。

通常確定胎兒血型的方法有:經(jīng)腹取絨毛膜或羊膜腔穿刺取羊水或取臍帶血，或用免疫方法檢測胎兒血型物質(zhì)的表面抗原，或利用這些物質(zhì)中提取的胎兒DNA，通過分子生物學(xué)方法測定胎兒血型［8］。這些結(jié)果準(zhǔn)確，但對孕婦來說均為有創(chuàng)性操作，而且有損傷胎兒的危險，還可能導(dǎo)致流產(chǎn)。因此，臨床上應(yīng)用很謹慎，規(guī)定了嚴(yán)格適應(yīng)證。

筆者利用PCR-RFLP技術(shù)建立了從O型孕婦外周血提取DNA檢測胎兒血型的方法，對139例丈夫為非O型的O型孕婦進行研究分析，新生兒出生前后血型檢測符合率為94.24%(131/139)。孕中期血型檢測與出生后檢測符合率為91.95%(80/87)，孕晚期血型檢測與出生后檢測符合率為98.08%(51/52)，隨著妊娠月份的增加新生兒出生前后血型檢測的符合率逐漸增加。

利用孕婦血漿中游離的胎兒DNA來進行產(chǎn)前診斷是一條可行的無創(chuàng)性檢測途徑［1，2］。該方法只需抽取少量的孕婦外周血就可進行，操作簡便，對孕婦和胎兒均無損傷。應(yīng)用PCR-RFLP分析檢測血型，所需模板量少，花費時間短，經(jīng)濟實惠且檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，易于被患者接受，容易在臨床上推廣應(yīng)用，因此對于母胎血型不合的診斷和新生兒溶血病的預(yù)防具有重要的價值和現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

1 Zolotukhina TV，Shilova NV，Voskobocva EY.Analysis of cell-free fetal DNA in plasma and serum of pregnant women［J］.Histochem Cytochem，2005，53(3):297-299

2 Saito H，Sckizawa A，Morimoto T，et al.Prenatal DNA diagnosis of a single-gene disorder from maternal plasma［J］.Lancet，2000，356:1170

3 Chin RW，Poon LL，Lau TK，et al.Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma［J］.Clin Chem，2001，47(9):1607-1613

4 Yamamoto F，Marken J，Tsuji T，et al.Cloning and characterization of DNA complementary to human UDPGalNAc:Fucal→2Gal→3GalNAc transferase(histo-blood group A transfrase)mRNA［J］.J Bio Chem，1990，265(2):1146-1150

5 Lee JC，Chang JG.ABO genotyping by polymerase chain reaction［J］.J FORENSIC Sci，1992，37(5):1269-1274

6 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.南京:東南大學(xué)出版社，2006:246-251

7 蘭炯采，贠中橋，陳靜嫻.輸血免疫血液學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:163

8 王鋒良，張元珍.利用孕婦血漿中胎兒DNA檢測胎兒血型的意義［J］.武漢大學(xué)學(xué)報.2006，27(3):398