劉丹丹 陳麗瓊 仇 容 銀國利 沈香娣

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多能成體干細(xì)胞，因具有取材方便、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低和廣泛的分化潛能而成為目前細(xì)胞治療、基因治療和組織工程方面的研究熱點(diǎn)。不同組織來源的MSCs在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、地塞米松、低血清或無血清培養(yǎng)基等多種誘導(dǎo)體系的作用下，可以成功地定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，不同程度表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)表型，甚至形成血管網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，成為血管組織工程和缺血組織細(xì)胞移植的理想種子細(xì)胞［1～3］。但MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制目前尚不清楚，其分化過程的調(diào)控靶標(biāo)尚未確立。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVECs)進(jìn)行了基因組規(guī)模的表達(dá)差異分析，結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1.材料:hMSCs和hUVECs分別從健康志愿成人骨髓、臍帶靜脈分離獲得;淋巴細(xì)胞分離液percoll、低糖DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO;優(yōu)等胎牛血清購自HYCLONE;UNIQ—10柱式RNA抽提試劑盒購自上海生工;基因芯片BiostarH—40S為上海博星基因公司產(chǎn)品。

2.方法:(1)hMSCs的分離、培養(yǎng):取健康成人骨髓5～10ml，離心沉淀血細(xì)胞，疊加到percoll分離液上，離心后吸取單個(gè)核細(xì)胞層，10%FBS的L-DMEM懸起，接種于24孔培養(yǎng)板中。3天后換液，hMSCs貼壁生長。以后每3天換液，細(xì)胞80%融合，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，收集P5～P6代細(xì)胞待用。(2)hUVECs的分離、培養(yǎng):酶消化法收集hUVECs，接種于培養(yǎng)瓶中，加M200培養(yǎng)基，擴(kuò)增培養(yǎng)傳至P3代備用。(3)hMSCs和hUVECs RNA的提取、分析:收集hMSCs和hUVECs各約(1～2)×107細(xì)胞，UNIQ-10柱式RNA抽提試劑盒分離細(xì)胞總RNA，測定所提RNA的OD260、OD280，計(jì)算RNA含量及純度。瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)總RNA中18S、28S、5S RNA的完整性并進(jìn)行熱穩(wěn)定性驗(yàn)證。(4)hMSCs和hUVECs RNA的芯片檢測及分析:以hMSCs、hUVECs為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別用Cy5、Cy3熒光素標(biāo)記，依次進(jìn)行預(yù)雜交、探針標(biāo)記、雜交、洗片、掃描與分析操作。Scan Array 4000掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 3.0軟件進(jìn)行圖像處理，ImaGene 3.0軟件分析Cy5、Cy3熒光信號(hào)強(qiáng)度和比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每張基因芯片BiostarH-40S含4096個(gè)點(diǎn)，其中包括控制系統(tǒng)(148個(gè)基因)和有效基因(3948個(gè)基因)?？刂葡到y(tǒng)中設(shè)16個(gè)空白對(duì)照用以排除芯片掃描時(shí)的背景信號(hào)，判別不同樣品間是否存在交叉污染;16個(gè)陰性對(duì)照檢驗(yàn)雜交時(shí)是否存在外源性污染;20個(gè)內(nèi)參校準(zhǔn)熒光信號(hào)強(qiáng)度;96個(gè)管家基因均衡Cy5、Cy3值，保證雜交結(jié)果的可靠性。(5)原位雜交檢測:將細(xì)胞固定在玻片上，用含5μg/L蛋白酶，37℃水浴消化10min。PBS洗滌后，梯度乙醇脫水，干燥。加入地高辛—RNA探針進(jìn)行雜交，PBS洗滌后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，孵育4h加入顯色液，室溫避光顯色，鏡下控制，終止反應(yīng)。黑色顆粒為陽性結(jié)果。

結(jié) 果

1.hMSCs和hUVECs的RNA鑒定:經(jīng)純化，hMSCs和hUVECs的RNA OD260/OD280比值均在2.0左右，純度較高，符合基因芯片檢測的要求。變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，常溫下和70℃保溫1h電泳圖譜上都可觀察到清晰的28S、18S條帶，5S條帶相對(duì)較弱，證明了所提RNA的完整性和熱穩(wěn)定性。

圖1 hMSCs和hUVECs的RNA的瓊脂糖凝膠電泳譜

2.hMSCs和hUVECs的基因芯片表達(dá)差異:根據(jù)差異表達(dá)篩選條件:①Cy5、Cy3值均＞200或其一＞800;②Cy5/Cy3比值 ＜0.5或者 ＞2。在所檢測的3948條有效基因中，hMSCs和hUVECs的差異表達(dá)基因?yàn)?27條，3321條基因在 hMSCs和hUVECs之間表達(dá)無明顯差異，約占有效基因的84%，表1列出了非差異表達(dá)的前19條基因。差異表達(dá)的627條基因中，hMSCs高表達(dá)基因283條，約占7.2%，表2列出了顯著高表達(dá)的前19條基因;hMSCs低表達(dá)基因共344條，約占8.7%，表3列出了顯著低表達(dá)的前19條基因。

3.原位雜交分析:為了檢驗(yàn)基因芯片檢測結(jié)果的可靠性，我們采用了原位雜交方法來驗(yàn)證hMSCs和hUVECs細(xì)胞中部分差異表達(dá)的基因，包括hMSCs高表達(dá)的纖維連接蛋白(FN1)基因、Ⅳ型膠原基因、表皮生長因子受體(EGFR)基因和血小板源性生長因子受體(PDGFR)基因;hMSCs低表達(dá)的Ⅷ因子基因。雜交結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。

表1 hMSCs和hUVECs共表達(dá)的部分基因

表2 hMSCs高表達(dá)的部分基因

表3 hMSCs低表達(dá)的部分基因

討 論

從基因芯片檢測的hMSCs和hUVECs表達(dá)的基因功能來看，主要包括以下5大類:①細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)蛋白基因;②細(xì)胞受體相關(guān)基因;③細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白相關(guān)基因;④發(fā)育相關(guān)基因;⑤蛋白翻譯、合成相關(guān)基因。

在非差異表達(dá)基因中，hMSCs除了顯著高表達(dá)Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)等和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子家族基因外，還高表達(dá)內(nèi)皮分化相關(guān)因子1(EDF1)、溶血磷脂酸受體1(LPAR 1)、DNAJB9、血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)等8個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞早期分化發(fā)育相關(guān)基因。

EDF1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化，在連接調(diào)控蛋白和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制上起橋接分子的作用，在通用轉(zhuǎn)錄因子TATA結(jié)合蛋白和基因特異性激活因子之間起轉(zhuǎn)錄輔助激活因子的功能，控制內(nèi)皮分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。溶血磷脂酸受體1(LPAR 1)是G-蛋白偶聯(lián)的受體超家族成員，和溶血磷質(zhì)酸結(jié)合后參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)皮分化鞘磷脂G-蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、遷移等。近來已有實(shí)驗(yàn)證明人脂肪組織來源的MSCs在人肺腺癌細(xì)胞A549的誘導(dǎo)下，通過LPA-LPAR1介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制在腫瘤微環(huán)境的血管生成中有重要作用［4］。DNAJB9屬于熱休克蛋白Hsp40家族成員，調(diào)節(jié)70 kDa HSP的ATP酶活性，參與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中，組織相容性白細(xì)胞抗原HLA-B35上調(diào)內(nèi)皮素1和下調(diào)NO合酶的過程［5］。因此，MSCs具有內(nèi)皮分化的分子基礎(chǔ)，為MSCs作為血管組織工程的種子細(xì)胞提供了細(xì)胞遺傳學(xué)和免疫學(xué)依據(jù)。

以內(nèi)皮細(xì)胞作對(duì)照，hMSCs主要高表達(dá)纖維連接蛋白1(FN1)和Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型膠原等細(xì)胞骨架蛋白基因;轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、基質(zhì)細(xì)胞源性因子1(SDF-1)、脂肪分化相關(guān)蛋白和表皮生長因子受體(EGFR)等與多種方向細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子/受體基因。FN與細(xì)胞膜受體整合素間的相互作用是細(xì)胞黏附與遷移的重要機(jī)制，其分子中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位點(diǎn)是重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可與多種細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞表面受體相結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的緊密接觸，影響細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的組裝，增強(qiáng)細(xì)胞的定向遷移，從而影響細(xì)胞的生長分化。SDF-1基因編碼基質(zhì)細(xì)胞來源的旁分泌家族成員，和受體CXCR4結(jié)合可活化血細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和腫瘤的轉(zhuǎn)移［6］。

相反，hMSCs低表達(dá)的344個(gè)基因中，細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白基因所占比例最大，如1-磷酸-鞘氨醇受體1(S1PR1)、CTNNB1、PDGFB 等;其次是細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，如趨化因子受體4(CXCR4)、血管生成素2(ANG-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等;再次是蛋白翻譯、合成基因，如vWF、CD34等。

趨化因子受體4(CXCR4)是CXC趨化因子SDF-1的特異性受體，兩者在卵泡生長、發(fā)育和血管新生過程中有重要作用［7］。VEGF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，增加對(duì)SDF-1的反應(yīng)性，促進(jìn)新生血管的形成，其機(jī)制可能和VEGF刺激轉(zhuǎn)錄因子與CXCR4基因啟動(dòng)子區(qū)域SP1位點(diǎn)的結(jié)合有關(guān)。β1連環(huán)蛋白(CTNNB1)是一重要的細(xì)胞黏附分子和信號(hào)傳導(dǎo)因子，與E-Cad結(jié)合后形成細(xì)胞內(nèi)的黏著復(fù)合體，起轉(zhuǎn)錄激活作用，啟動(dòng)細(xì)胞增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞大量增殖。VEGF基因啟動(dòng)子包含7個(gè)CTNNB1的結(jié)合位點(diǎn)，CTNNB1可調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系［8］。PDGFB是PDGF家族成員之一，是間充質(zhì)細(xì)胞的重要有絲分裂因子，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成方面有積極作用。因此，VEGF和PDGF成為近年來誘導(dǎo)MSCs內(nèi)皮分化的首選誘導(dǎo)因子。

1-磷酸-鞘氨醇受體1(S1PR1)參與脂類分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)分子和促血管生成因子。S1PR1和配體SSP(鞘氨醇1-磷酸化酶)的結(jié)合具有高親和性、高特異性，并可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)與血管生成有關(guān)的反應(yīng)［9，10］。血管生成素 -2(Ang-2)是血管生成素1和內(nèi)皮細(xì)胞酪氨酸激酶(TIE-2)拮抗劑，所編碼的蛋白可阻止血管生成素1引起的血管重建，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這些基因的功能雖然已有深淺不同的研究，但大多是在其他細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，尤其是在間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中的作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

以上實(shí)驗(yàn)研究可見，由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細(xì)胞是可行的，但分化機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，涉及多基因的表達(dá)變化，包括一系列細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu);不同方向細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào);細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)以及內(nèi)皮相關(guān)發(fā)育基因的上調(diào)，還涉及一些DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄因子基因和蛋白翻譯、合成相關(guān)基因的變化。這些差異表達(dá)的基因代表了一個(gè)與MSCs內(nèi)皮分化相關(guān)的、特異的基因表達(dá)譜。正是這些基因的表達(dá)變化，使MSCs在各種內(nèi)皮誘導(dǎo)體系的作用下表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的抗原標(biāo)志，甚至表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)功能。

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