孫曉萍，侯麗娟，王曉紅，唐 方

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052）

大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及操作規(guī)范探討*

孫曉萍，侯麗娟，王曉紅，唐 方

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052）

[目的]建立大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型，探討建立模型的操作規(guī)范。[方法]雄性Wistar大鼠，除正常對(duì)照（NC）組，其余大鼠用100mg/kg2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/50%乙醇溶液建立潰瘍性結(jié)腸炎急性模型，在造模10 d后，當(dāng)所有模型大鼠便潛血轉(zhuǎn)為“1+”時(shí)，隨機(jī)抽取模型大鼠觀察結(jié)腸病理組織學(xué)改變，剩余模型大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照（PC）組、UC組，用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）水溶液或生理鹽水進(jìn)行致炎誘導(dǎo)結(jié)腸炎復(fù)發(fā)，造模后觀察各組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)期處死觀察結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）及病理組織學(xué)改變。[結(jié)果]與正常對(duì)照組比較，慢性潰瘍性結(jié)腸炎組飲DSS后再次出現(xiàn)結(jié)腸炎發(fā)作，DAI及CMDI評(píng)分明顯增高（P<0.05），而陽(yáng)性對(duì)照組逐漸好轉(zhuǎn)；病理組織學(xué)改變亦有顯著差異。[結(jié)論]采用TNBS/乙醇溶液首次致炎，用DSS間斷進(jìn)行誘導(dǎo)復(fù)發(fā)，可以模擬UC急性期與緩解期交替發(fā)作的特點(diǎn)，病理組織學(xué)改變與人類相似。

2，4，6-三硝基苯磺酸；葡聚糖硫酸鈉；慢性潰瘍性結(jié)腸炎；動(dòng)物模型

慢性潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因不明的結(jié)腸和直腸炎性病變,臨床表現(xiàn)為腹痛腹瀉、黏液膿血便及不同程度的全身癥狀，呈現(xiàn)緩解復(fù)發(fā)交替出現(xiàn)的發(fā)病特點(diǎn)。近年來(lái)UC在中國(guó)發(fā)病總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，建立與之相類似的模型對(duì)于深入研究此疾病具有重大意義。目前，有多種用于UC研究的動(dòng)物模型[1]，化學(xué)物誘導(dǎo)法如乙酸法、葡聚糖硫酸鈉法、惡唑酮法等，免疫法如2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法、二硝基氯苯法等，另還有免疫復(fù)合法、特定基因敲除、T細(xì)胞移植等模型，這些模型各具優(yōu)勢(shì)，但始終缺少UC緩解復(fù)發(fā)交替出現(xiàn)的變化。TNBS/乙醇模型以及5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）致UC模型以價(jià)廉又與人病變相似的優(yōu)勢(shì)成為炎癥性腸病的經(jīng)典模型被普遍應(yīng)用，目前認(rèn)為T(mén)NBS模型慢性緩解期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，有文獻(xiàn)表明人為反復(fù)運(yùn)用DSS刺激，可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)類似人類UC急性期與緩解期交替出現(xiàn)的變化，且病變與人類類似[2]，采兩者之長(zhǎng)聯(lián)合應(yīng)用探索UC慢性模型的建立，將為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

1.2 主要器材及試劑 5%TNBS（批號(hào)：068k5001，美國(guó)Sigma公司），D SS（分子量5000，日本光和純藥株式會(huì)社，批號(hào)：STF2213 REFBMS622），無(wú)水乙醇（天津江天化工技術(shù)公司），便潛血（OB）試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），8號(hào)導(dǎo)尿管，1mL注射器。

1.3 造模方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將40只大鼠于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、模型組30只。

1.3.2 模型制備 1）5%TNBS與50%無(wú)水乙醇以體積1∶1配成TNBS/乙醇混合液；DSS用蒸餾水配成5%DSS水溶液。2）大鼠禁食不禁水24 h，稱質(zhì)量，采用10%水合氯醛以3mL/kg劑量腹腔注射麻醉后，將8號(hào)導(dǎo)尿管輕輕插入肛門(mén)上端8 cm，以4mL/kg（相當(dāng)于TNBS 100mg/kg）劑量，用1mL注射器緩慢注入相應(yīng)體質(zhì)量比例造模劑，模型組為T(mén)NBS，NC組為生理鹽水，再注入0.5mL空氣，倒立5min，仰臥歸籠，保溫?zé)粽丈渲链笫筇K醒，自由飲食。實(shí)驗(yàn)第11天時(shí)模型大鼠便潛血已轉(zhuǎn)為“1+”，隨機(jī)抽取10只處死取結(jié)腸組織進(jìn)行蘇木—伊紅（HE）染色，剩余模型大鼠隨機(jī)分為PC組、UC組，進(jìn)行誘導(dǎo)復(fù)發(fā)，UC組以5%DSS水溶液代替飲水自由飲用24 h，NC組及PC組則飲用生理鹽水；實(shí)驗(yàn)第16天時(shí)模型大鼠便潛血又轉(zhuǎn)為“1+”，再予DSS、生理鹽水自由飲用24 h進(jìn)行第3次致炎，實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)處死取材。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI） 自造模后第1天起，每日觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、皮毛色澤、體質(zhì)量、大便性狀及便隱血狀況。按表1進(jìn)行評(píng)分[3-4]，見(jiàn)表1。

表1 DAI評(píng)分表Tab.1 DAIscore table

1.4.2 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI） 剖取大鼠肛門(mén)至盲腸末端的結(jié)腸段，清理腸系膜及粘連組織，沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，冰生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，平鋪于濾紙上，參照文獻(xiàn)[5-6]按表2立即進(jìn)行肉眼大體黏膜損傷程度評(píng)分，見(jiàn)表2。

表2 CMDI評(píng)分表Tab.2 CMDIscore table 分

1.4.3 病理組織學(xué)觀察 取大鼠結(jié)腸病變最明顯處組織一小部分，用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，兩組正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多組正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，兩組及多組偏態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI） 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)終期CMDI評(píng)分比較（±s）Tab.3 Com parison of CMDIscoreat the end of the experimen（t±s） 分

表3 實(shí)驗(yàn)終期CMDI評(píng)分比較（±s）Tab.3 Com parison of CMDIscoreat the end of the experimen（t±s） 分

注：與 NC 組比較，*P<0.01，**P<0.05；與 PC 組比較，△△P<0.05。

組別 n CMDI NC組 10 0 UC 組 10 4.56±1.74*△△實(shí)驗(yàn)第 11 天 10 6.13±1.86*△△PC 組 10 1.33±0.50**

2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI） 結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 TNBS致炎前10 d DAI評(píng)分比較（±s）Tab.4 Com parison of DAIscore ofeach group in the first ten days（±s） 分

表4 TNBS致炎前10 d DAI評(píng)分比較（±s）Tab.4 Com parison of DAIscore ofeach group in the first ten days（±s） 分

注：與NC組比較，*P<0.01。

組別 n 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天NC組 10 0 0 0 0 0 TNBS 首次致炎 30 2.50±0.39*1.67±0.88*1.63±0.90*1.22±0.55*0.89±0.37*

2.3 組織病理學(xué)觀察（光鏡×100倍） 結(jié)果見(jiàn)圖1～圖4。

3 討論

一般情況：應(yīng)用TNBS造模后，模型大鼠均出現(xiàn)蜷臥少動(dòng)，被毛松散，肉眼血便或黏液稀便，便次增多，體質(zhì)量不同程度下降，約1周時(shí)間癥狀即有緩解，大便變實(shí)，便潛血陽(yáng)性，體質(zhì)量回增。誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后，UC組又出現(xiàn)兩次結(jié)腸炎發(fā)作，以稀薄血便、體質(zhì)量下降為主要癥狀，復(fù)發(fā)高峰期在飲DSS當(dāng)天及飲后1～2 d，PC組狀態(tài)良好，體質(zhì)量繼續(xù)增長(zhǎng)，便潛血逐漸減輕或轉(zhuǎn)陰。正常對(duì)照組大鼠實(shí)驗(yàn)全程狀態(tài)良好，大便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)。

表5 復(fù)發(fā)致炎后DAI評(píng)分比較（±s）Tab.5 Com parison of DAIscore after inflammation recurrence（±s） 分

表5 復(fù)發(fā)致炎后DAI評(píng)分比較（±s）Tab.5 Com parison of DAIscore after inflammation recurrence（±s） 分

注：與 NC 組比較，*P<0.01；與 PC 組比較，△P<0.01。

組別 n NC組 10 UC組 10 PC組 10第12天 第13天 第14天 第15天0 0 0 0 2.13±1.02*△ 1.53±0.95*△ 1.47±0.72*△ 1.27±0.77*△0.67±0.00* 0.67±0.01* 0.67±0.00* 0.67±0.01*第16天0 1.20±0.63*△0.70±0.11*第17天 第18天 第19天 第20天0 0 0 0 2.07±1.01*△ 1.13±0.55*△ 1.03±0.32*△ 0.87±0.36*△0.67±0.00* 0.67±0.00* 0.60±0.08* 0.13±0.28

表3 CMDI統(tǒng)計(jì)證實(shí)UC組大鼠結(jié)腸黏膜明顯損傷（P<0.01或 P<0.05），而PC組結(jié)腸黏膜損傷趨近恢復(fù)，但未恢復(fù)到正常水平（P<0.01），仍處于TNBS致炎緩解期，這與目前認(rèn)為T(mén)NBS致UC模型的緩解期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)一致。光鏡下UC組組織病理與PC組、NC組相比可見(jiàn)潰瘍、瘢痕，潰瘍處黏膜缺失、纖維組織及小血管增生、滲出，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變以黏膜和黏膜下層為主，而潰瘍和炎細(xì)胞浸潤(rùn)正是評(píng)判潰瘍性結(jié)腸炎模型成功的主要標(biāo)準(zhǔn)。隔日抽取大鼠DAI評(píng)分比較，如表4所示，應(yīng)用TNBS致炎后模型大鼠DAI評(píng)分顯著增高,結(jié)合圖2病理表現(xiàn)證實(shí)：應(yīng)用TNBS致炎成功，模型第11天時(shí)仍可見(jiàn)潰瘍及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。由表5提示，未予DSS刺激，PC組DAI評(píng)分逐漸好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)終期時(shí)與NC組相比未見(jiàn)顯著差異，UC組大鼠給予DSS刺激后出現(xiàn)相應(yīng)的DAI升高（P<0.01）。肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜發(fā)現(xiàn)，NC組大鼠色澤淡紅，黏膜皺襞清晰完整，腸壁厚薄適中；TNBS造模第11天時(shí)可見(jiàn)糜爛、潰瘍，部分大鼠伴腸粘連；UC組大鼠見(jiàn)潰瘍、瘢痕、肉芽腫，病灶腸壁變厚，部分大鼠有腸粘連；PC組腸黏膜皺襞變淺，無(wú)明顯潰瘍。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)規(guī)范實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)操作對(duì)于提高成模率十分必要，探討如下。1）DSS間斷給飲標(biāo)準(zhǔn)：正式建模前預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠每隔1日飲用1次DSS，實(shí)驗(yàn)終期大鼠死亡過(guò)半，推測(cè)因DSS具有和肝素同樣的抗止血抗凝血作用，可導(dǎo)致嚴(yán)重的脫水和肝凝血機(jī)制損害，致動(dòng)物失血過(guò)多死亡，其可能死因已被報(bào)道過(guò)[7]；而每隔至少4 d、大鼠便潛血已恢復(fù)為“1+”后再給飲則大鼠無(wú)死亡。因此，給飲DSS應(yīng)以便潛血“1+”為度，每次給飲24 h，兩次給飲間隔至少4 d。2）麻醉后保溫：低溫是麻醉常見(jiàn)的并發(fā)癥，可導(dǎo)致藥物代謝下降、抗感染能力下降等并發(fā)癥。文獻(xiàn)報(bào)道麻醉后采取保溫措施能夠縮短麻醉恢復(fù)時(shí)間，減少各種并發(fā)癥的發(fā)生，降低麻醉風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。實(shí)驗(yàn)在24℃室溫使用水合氯醛常規(guī)3mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，高達(dá)10%的麻醉大鼠未蘇醒死亡，采取保溫大鼠可全部蘇醒，提示保溫是降低模型大鼠制備過(guò)程中因麻醉而死亡的重要因素，是提高成模率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。經(jīng)此規(guī)范，將有效提高成模率。

以上結(jié)論表明，單用TNBS 1次致炎，約3周時(shí)間大鼠結(jié)腸大致愈合，而聯(lián)合DSS在TNBS致炎后間斷刺激，能誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)類似人類UC急性期與緩解期交替出現(xiàn)的變化，這是一般UC模型所不具備的。此模型以稀薄血便及體質(zhì)量下降為主要癥狀，病變主要局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，以潰瘍和炎細(xì)胞浸潤(rùn)為主，與人類UC病變相似。該模型還具有制作簡(jiǎn)單，周期短，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可作為平臺(tái)用于深入了解UC的病因、發(fā)病機(jī)制，有助于藥物在不同時(shí)期的介入研究以及中醫(yī)中藥辨證論治的探索，能滿足一般模型不能滿足的長(zhǎng)期長(zhǎng)效實(shí)驗(yàn)觀察，對(duì)UC緩解復(fù)發(fā)的更深入探索研究具有重要價(jià)值。

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Reproducing chronic ulcerative colitis in ratsand itsprocedure conform ity

SUNXiao-ping,HOU Li-juan,WANGXiao-hong,TANGFang
（TC M Department,GeneralHospitalof Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300052,Chin a）

[Objective]To reproduce chronic ulcerative colitis(UC)in rats and establish its procedure conformity.[Methods]MaleWistar ratswere random ly divided into normal control group andmodel group.Acute colitiswas induced by rectal administration of2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution(TNBS)dissolved in 50%ethanol,100mg/kg.Ten days later,when thestooloccultblood of ratsshowed“1+”,tenmodel ratswere random ly selected and killed to observe colon histologicalchanges;the othermodel ratswere random ly divided into positive(PC)group and(UC)group.The occurrence of colitiswas induced with drinking 5%dextran sulfate sodium(DSS)solution or normal saline.Aftermodeling the disease activity index(DAI)was observed in each group.The colonicmucosal damage index(CMDI)and the histological changeswere assessed et the end on experiment.[Results]Compared with normal group and positive group,DAI and CMDIscores of chronic ulcerative colitis group were significantly increased (P<0.05);the histological changeswere also differed significantly between them.[Conclusion]The chronic ulcerative colitiswas successfully reproduced in rats.Themethod ofusing TNBS/alcohol solution to induce inflammation firstand using DDS to induce its recurrence can imitate the characteristics of replaced onsetof acute and chronic stage in UCgroup.Ithassimilar pathological changes to that in human body.

2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid;dextran sulfatesodium;chronic ulcerative colitis;animalmodel

R574

A

1672-1519（2012）03-0270-04

天津市科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（06FZZDSH00405）。

孫曉萍（1986-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理及消化系統(tǒng)疾病研究。

唐 方。

2012-01-05）