蔡高軍，何國(guó)平，戚傳平

（江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科,常州 213000）

內(nèi)皮脂肪酶（endothelial lipase,EL）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的甘油三酯脂肪酶家族新成員，可能通過(guò)裂解高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）及其他多條途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)EL基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系密切[2,3]。Yamakawa-Kobayashi等[4]和 Hutter等[5]研究均表明EL啟動(dòng)子區(qū)-384A/C基因多態(tài)性（rs3813082）與血漿HDL水平相關(guān)。但到目前為止，EL-384A/C基因多態(tài)性是否與中國(guó)常州地區(qū)漢族人群老年人急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS）發(fā)病存在相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)到。本研究旨在通過(guò)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism，PCR- RFLP）方法，檢測(cè)241例老年ACS患者和181例健康體檢者的基因型，以了解中國(guó)常州地區(qū)漢族人群EL-384A/C基因多態(tài)性頻率分布，并探討其與老年ACS之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

2008年8月至2011年1月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的老年ACS患者241例，其中男156例，女85例，年齡60～88歲，平均（69.70±6.77）歲，ACS定義按照美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[6]，大部分患者進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影檢查，結(jié)果由兩名有經(jīng)驗(yàn)的心導(dǎo)管室醫(yī)師判斷。對(duì)照組為同期住院并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查排除冠心病者181例，其中男88例，女93例，年齡60～93歲，平均（67.12±6.12）歲。入選患者均為中國(guó)常州地區(qū)漢族人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有感染性疾病、風(fēng)濕性心臟病、嚴(yán)重肝腎功能不全和腫瘤等疾病。該研究征得所有入選對(duì)象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 收集所有入選對(duì)象的基本資料，包括年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史和冠狀動(dòng)脈造影等結(jié)果。

1.2.2 入院次日空腹抽取靜脈血檢測(cè)生化指標(biāo) 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和血糖水平檢測(cè)采用氧化酶法；血清載脂蛋白-A1（apolipoprotein，Apo-A1）、Apo-B 和脂蛋白（a）[lipoprotein（a），LP（a）]水平檢測(cè)采用放射免疫法。各生化指標(biāo)均由全自動(dòng)生化分析儀（奧林巴斯AU5400）檢測(cè)分析。

1.2.3 EL-384A/C基因型的檢測(cè) 采用標(biāo)準(zhǔn)酚氯法提取患者外周血基因組DNA，采用PCR-RFLP方法檢查EL-384A/C基因型。參照文獻(xiàn)[4]合成引物，上游引物 5'-TAG CTC CGC CGG GTT ATT GTG C-3'，下游引物5'-CCA GAT CCT CCT CTC CCC ACT G-3'，引物由大連寶生物有限公司合成?？侾CR反應(yīng)體系50μl，包括 1μl基因組 DNA，5μl 10×PCREx TaqBuffer (Mg2+),4μl dNTP Mixture,0.25μlTaKaRaEx Taq,上下游引物各 1μl，去離子水補(bǔ)充至 50μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45s，66℃退火45s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaI （由大連寶生物有限公司提供）酶切，37.0℃水浴過(guò)夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠紅染色的 3%瓊脂糖凝膠 100V電泳45min，紫外燈下觀察分型。約10%左右樣本被隨機(jī)重復(fù)檢查。為證實(shí)我們的結(jié)果，部分PCR產(chǎn)物送上海生工行基因測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。老年ACS的多種相關(guān)因素分析采用logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與ACS組患者一般資料比較

與對(duì)照組相比，老年ACS組患者以男性居多、年齡較大（P＜0.05），高血壓、糖尿病和吸煙者比率明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。老年ACS組血清TG、TC/HDL-C 和LDL-C/HDL-C明顯高于對(duì)照組，而血清HDL-C水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；表1）。

表1 對(duì)照組與ACS組患者一般資料Table 1 The clinical characteristics controls and ACS group

2.2 EL-384A/C基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型的鑒定

PCR擴(kuò)增獲得254bp的特異性片段。該片段經(jīng)HhaI限制性內(nèi)切酶酶切后顯示 AA（254bp）、AC（254bp、142bp和 112bp）和 CC（142bp和 112bp）三種基因型（圖1）。

2.3 對(duì)照組及老年ACS組EL-384A/C基因型分布

兩組 EL-384A/C 基因型分布達(dá)到 Hardy-Weinberg平衡（分別為 0.13，1.73；P＞0.05），具有群體代表性。對(duì)照組AA、AC、CC基因型和A、C等位基因分布頻率分別為 133（73.48%）、45（24.86%）、3（1.66%）和 85.91%、14.09%；老年ACS組 AA、AC、CC基因型和 A、C等位基因分布頻率分別為 178（73.86%）、61(25.31%)、2(0.83%)和86.51%、13.49%。兩組間基因型及等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖1 EL-384A/C PCR產(chǎn)物酶切電泳圖Figure 1 Restriction endonuclease digestion of EL-384A/C PCR products

表2 對(duì)照組及ACS組EL-384A/C基因型及等位基因頻率分布Table 2 The genotype and allele frequencies of EL-384 A/C between controls and ACS group [n(%)]

2.4 EL-384A/C不同基因型間血脂水平及血脂比值比較

EL-384A/C不同基因型間血脂水平及血脂比值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.5 老年ACS危險(xiǎn)因素logistic回歸分析

將基因型、性別、年齡、糖尿病、高血壓、吸煙和血脂納入回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在校正性別、年齡等因素后，EL-384A/C基因多態(tài)性與老年ACS發(fā)病仍然無(wú)明顯相關(guān)性（表4）。

表3 不同基因型間血脂水平及血脂比值比較Table 3 Comparison of lipids and the ratios between different genotypes (±s)

表3 不同基因型間血脂水平及血脂比值比較Table 3 Comparison of lipids and the ratios between different genotypes (±s)

注: TC: 總膽固醇; TG: 甘油三酯; HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇

基因型 n TC(mmol/L) TG(mmol/ L) HDL-C(mmol/ L) LDL-C(mmol/ L) TC/HDL-C TG/HDL-C LDL-C/HDL-C AA 311 4.51±1.01 1.72±1.14 1.16±0.32 2.65±0.76 4.26±1.12 1.73±1.94 2.42±0.89 AC+CC 111 4.67±1.03 1.69±1.14 1.20±0.36 2.75±0.74 4.42±1.17 1.50±1.01 2.43±0.83

表4 老年ACS危險(xiǎn)因素logistic回歸分析Table 4 The logistic regression analysis of risk factors in aged ACS

3 討 論

EL定位于人類染色體18q21.1，由483個(gè)氨基酸組成，分子量約為 55ku。EL主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，與肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LPL）三者同屬于脂肪酶，共同參與脂蛋白代謝。EL主要表現(xiàn)為較強(qiáng)的磷脂酶活性，作用底物為HDL-C，通過(guò)在內(nèi)皮細(xì)胞表面介導(dǎo)HDL-C與硫酸肝素蛋白聚糖結(jié)合后，水解HDL-C產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血卵磷脂以及Apo-A1，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EL也具有較弱的甘油三酯酶活性。

自從2002年deLemos等[7]首次發(fā)現(xiàn)EL基因17個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)以來(lái)，陸續(xù)又有多個(gè)新的多態(tài)性位點(diǎn)被報(bào)道。到目前為止，對(duì)于 EL基因多態(tài)性是否影響血脂水平以及是否與冠心病發(fā)病有關(guān)，國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論尚不一致[2,3,8]。2003年Yamakawa-Kobayashi等[4]研究日本學(xué)齡兒童HDL-C水平與EL基因變異的關(guān)系時(shí)，報(bào)道了 6個(gè)EL基因變異，并且發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子-384A/C和第 10個(gè)外顯子 2237G/A的變異與HDL-C水平升高有關(guān)。2006年，Hutter等[5]對(duì)日裔美國(guó)人家系人群研究中也發(fā)現(xiàn)-384A/C基因多態(tài)性與HDL水平有關(guān)，并且可能增加人群心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。最近黃焱等[9]對(duì)我國(guó)成都地區(qū) 214名正常人和103例高甘油三酯血癥患者EL基因-384A/C位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)人EL基因-384A/C多態(tài)位點(diǎn) C等位基因頻率為 0.178，但未見(jiàn)正常人和HTG患者之間C等位基因頻率存在差異。與AA基因型者比較，正常中國(guó)人 C等位基因攜帶者(AC及 CC型者)血清 HDL水平無(wú)顯著性差異。本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)常州地區(qū)漢族人群老年人存在EL-384A/C基因多態(tài)性，且這一多態(tài)性位點(diǎn)已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。C等位基因頻率為13.74%，與 Yamakawa-Kobayashi等和 Hutter等的研究結(jié)果一致，但是顯著低于黃焱等的報(bào)道（P＜0.05），這可能與入選人群不同有關(guān)。

對(duì)照組與老年 ACS組 EL-384A/C基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)校正性別、年齡、糖尿病、高血壓、吸煙、高脂血癥等冠心病危險(xiǎn)因素后，結(jié)果仍然表明該多態(tài)性與老年ACS無(wú)明顯相關(guān)性。而男性、高齡、糖尿病和 TG是老年ACS發(fā)病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，與AA基因型者比較，C等位基因攜帶者（AC+CC）HDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Yamakawa-Kobayashi等和Hutter等[4,5]的研究結(jié)果不同，兩組間其他血脂水平和血脂比值差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)上述結(jié)論不一致的原因可能為：等位基因頻率在不同種族人群存在較大差異；確定基因型所使用的試驗(yàn)方案不同，選擇偏差不容忽視；許多研究樣本數(shù)量不夠大、統(tǒng)計(jì)效能有限。

本研究首次對(duì) EL基因-384A/C多態(tài)性與老年ACS的發(fā)病進(jìn)行研究，結(jié)果顯示EL -384A/C基因多態(tài)性與老年ACS的發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性，提示該基因變異可能不是中國(guó)常州地區(qū)漢族人群老年 ACS發(fā)病的易感因素。但是由于本文病例數(shù)量有限，患者來(lái)源于常州地區(qū)漢族老年人群，尚需多地區(qū)、大樣本的研究對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，以及在功能學(xué)方面進(jìn)一步深入研究。

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