潘多鋒，張?jiān)聦W(xué)，申忠寶，王建麗，張瑞博，李道明，高 超，邸桂俐，劉錄祥，鐘 鵬

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

太空誘變育種是利用各類飛行器（衛(wèi)星、飛船或航天飛機(jī)）將農(nóng)作物種子及其他生物體樣品帶上外太空［1］，在空間特殊環(huán)境（宇宙射線、高真空、微重力等）作用下產(chǎn)生變異，獲得生物新品種的育種新技術(shù)［2，3］，被廣泛應(yīng)用于植物育種［4－8］。近年來(lái)，許多研究者將這一新的育種方法應(yīng)用于牧草研究。經(jīng)衛(wèi)星搭載的紅豆草（Onobrychis viciaefolia）、苜蓿（Medicago sativa、早熟禾（Poa pratensi）、冰草（Agropyron cristatum）、新麥草（Psathyrostachys juncea）等牧草品種，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有花期和生長(zhǎng)期延長(zhǎng)、抗病性增強(qiáng)、抗鹽性和抗旱性提高、早熟、植株矮化、葉片數(shù)增加等豐富的突變類型［9－14］，為優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和多抗牧草新品種的選育提供了豐富的遺傳材料。

羊草（Leymus Chinensis）又稱堿草，為多年生根莖型牧草，被譽(yù)為“禾本科牧草之王”，是現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系重點(diǎn)發(fā)展的牧草之一。羊草在自然界中以無(wú)性繁殖為主，有性繁殖為輔，其本身固有的“三低”問(wèn)題（成穗率低、結(jié)實(shí)率低、發(fā)芽率低），嚴(yán)重制約了羊草種質(zhì)資源的創(chuàng)新。因此，羊草新種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用已成為目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)選育出的羊草新品種很少，大多采用野生馴化選育，“三低”問(wèn)題仍然存在［15，16］。目前，空間誘變技術(shù)在羊草育種中的應(yīng)用研究很少有相關(guān)報(bào)道?！皩?shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星搭載羊草種子后對(duì)其萌發(fā)、細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、根尖細(xì)胞核畸變及染色體畸變等進(jìn)行了研究，探討衛(wèi)星搭載后羊草種子的萌發(fā)特性及細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，為我國(guó)羊草空間誘變育種研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

“實(shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星搭載的羊草為野生東北羊草，種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所提供。

1.2 搭載處理

“實(shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星是我國(guó)第1顆專用育種衛(wèi)星，2006年9月9日5：00在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心由長(zhǎng)征二號(hào)丙運(yùn)載火箭發(fā)射升空。衛(wèi)星運(yùn)行的近地點(diǎn)高度為187km，遠(yuǎn)地點(diǎn)高度463km，軌道傾角63°，在軌運(yùn)行15d，返回艙于9月24日10：43在四川遂寧成功返回。衛(wèi)星運(yùn)行期間回收艙內(nèi)溫度在7.21～20.72℃。

將羊草干種子3 000粒用白色棉布袋包裝注明，搭載于“實(shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星，為太空誘變（SP），相同數(shù)量的同批種子作為對(duì)照（ck）。

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)

發(fā)芽試驗(yàn)采用濾紙培養(yǎng)皿發(fā)芽法，將處理和對(duì)照種子放在鋪有單層濾紙9cm玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，3次重復(fù)，每重復(fù)50粒飽滿種子。發(fā)芽溫度16℃/28℃，12 h黑暗/12h光照。從第1粒種子萌發(fā)開(kāi)始，每天觀察、統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽數(shù)直至萌發(fā)結(jié)束。初計(jì)數(shù)時(shí)間為第6d，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為20d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取10個(gè)幼苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗長(zhǎng)度。

（1）發(fā)芽率＝發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

（2）發(fā)芽指數(shù)GI＝∑（Gi/Di）

式中：Gi為第i天的發(fā)芽率，Di為天數(shù)。

（3）活力指數(shù)DI＝GI×Ss式中：Ss為幼苗長(zhǎng)度［17］。

1.4 細(xì)胞學(xué)觀察

1.4.1 根尖染色體制片 將對(duì)照與搭載后的干種子50粒消毒清洗后分別放入培養(yǎng)皿中，置于25℃溫箱中培養(yǎng)至露白，4℃低溫處理48h，然后置25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，根尖長(zhǎng)至1.5cm剪下吸干，放在冰水混合物中冷處理20～22h，用卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）固定22h。將材料從固定液中取出，用溫水把根尖水洗2～3次；用預(yù)熱1mol/L鹽酸在60℃水浴下解離6min；取出后再用溫水沖洗2～3次，并用濾紙吸干，加入謝夫試劑染色3h，然后將根尖放入醋酸洋紅中復(fù)染48h，進(jìn)行染色體制片（對(duì)照和搭載處理各15張）。染色體觀察、取材時(shí)間非常關(guān)鍵，應(yīng)標(biāo)明根尖的具體取材時(shí)間（根尖的具體取材時(shí)間為根尖長(zhǎng)至1.0～1.5cm時(shí)取材，減數(shù)分裂和具體時(shí)間有關(guān)，未作減數(shù)分裂方面的試驗(yàn)）。

1.4.2 鏡檢 隨機(jī)抽取14個(gè)染色體制片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)統(tǒng)計(jì)，在20倍鏡下觀察，每個(gè)染色體制片更換4～5個(gè)視野，每張染色體制片統(tǒng)計(jì)280個(gè)細(xì)胞，Leica 4000 MB高倍顯微鏡下拍照。觀察、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)、分裂細(xì)胞數(shù)、正常分裂細(xì)胞數(shù)、微核數(shù)、染色體斷片數(shù)、染色體粘連數(shù)、游離染色體數(shù)、染色體橋數(shù)、落后染色體數(shù)以及染色體的其他畸變數(shù)目，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算：

（1）細(xì)胞分裂指數(shù)（%）＝（分裂細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)）×100

（2）染色體畸變率（%）＝（染色體總畸變數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)）×100

（3）核畸變率（%）＝（核總畸變數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 太空誘變對(duì)羊草種子萌發(fā)的影響

太空誘變處理羊草種子的發(fā)芽率21.44%，對(duì)照為26.50%；處理發(fā)芽指數(shù)為23.10，對(duì)照為25.06；處理的種子活力指數(shù)是118.99，對(duì)照為130.19。方差分析結(jié)果和對(duì)照間的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)處理均無(wú)差異（P＞0.05）。結(jié)果表明太空誘變對(duì)羊草種子萌發(fā)的影響不大（表1）。

表1 太空誘變下羊草種子的萌發(fā)Table 1 Effect of seed germination of Leymus chinensis on embarked by space flight

2.2 太空誘變下羊草根尖細(xì)胞有絲分裂和核畸變

太空誘變處理對(duì)羊草種子根尖細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生一定的影響（表2）。太空誘變根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)為8.97%，對(duì)照為7.19%，太空誘變處理比對(duì)照增加24.17%，說(shuō)明太空誘變可以促進(jìn)羊草種子根尖細(xì)胞有絲分裂。

表2 太空誘變對(duì)羊草根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)及核畸變的影響Table 2 Effect of the mitotic index and nuclear aberrations of root tip cells of Leymus chinensis on embarked by space flight

與對(duì)照相比，太空誘變后羊草根尖細(xì)胞在有絲分裂間期發(fā)生核畸變。太空誘變根尖細(xì)胞在有絲分裂間期出現(xiàn)了單微核和雙微核2種類型核畸變，核總畸變率為1.57%（表2）。其中，單微核率為0.93%，是主要的變異類型，占核總畸變的59.24%，雙微核畸變率為0.64%，占核總畸變的40.76%。

2.3 太空誘變對(duì)羊草根尖染色體畸變的影響

對(duì)照根尖染色體無(wú)畸變發(fā)生，太空誘變后則產(chǎn)生變異。太空誘變后羊草根尖細(xì)胞染色體在分裂中期出現(xiàn)染色體斷片、染色體粘連等畸變類型；在分裂末期出現(xiàn)染色體單橋、雙橋、落后染色體、游離染色體等畸變類型，染色體總畸變率為3.68%。其中，染色體斷片所占比例最大，占總畸變類型的32.34%，其次為染色體粘連（21.78%）和染色體單橋（16.85%），染色體雙橋變異最少，占總變異的9.24%（表3，圖1）。

表3 太空誘變對(duì)羊草根尖細(xì)胞染色體畸變的效應(yīng)Table 3 Chromosome aberrations of root tip cells in Leymus chinensis embarked by space flight

圖1 “實(shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星搭載后羊草根尖染色體的畸變類型Fig.1 Chromosome aberrations of Leymus chinensis embarked by space flight

3 討論和結(jié)論

3.1 太空誘變對(duì)羊草種子萌發(fā)的影響

許云遠(yuǎn)等［18，19］的研究表明，太空誘變對(duì)草地早熟禾、紅豆草、冰草和苜蓿等牧草種子的發(fā)芽率無(wú)顯著影響或影響不明顯，杜周和等［12］發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星搭載后高丹草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均受到不良影響，發(fā)芽能力降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，太空誘變處理對(duì)羊草種子萌發(fā)特性影響不大，雖然種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均低于對(duì)照，但差異不顯著（P＞0.05）。羊草的休眠類型屬萌發(fā)抑制物引起的生理性休眠，抑制物主要是脫落酸（ABA），主要抑制部位為胚乳，羊草種子的休眠是萌發(fā)抑制物與萌發(fā)促進(jìn)物（多種激素，如玉米素、赤霉素、生長(zhǎng)素等）綜合作用的結(jié)果［20］。太空誘變后造成羊草種子萌發(fā)能力降低的原因有待于進(jìn)一步的研究。

3.2 太空誘變對(duì)羊草細(xì)胞有絲分裂的影響

太空誘變是空間輻射、微重力和高真空等因素綜合作用的結(jié)果，在誘因上與地面單一的理化誘變因素完全不同，是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程。已有的研究表明，衛(wèi)星搭載對(duì)當(dāng)代種子根尖細(xì)胞有絲分裂有促進(jìn)（分裂指數(shù)增加）和抑制（分裂指數(shù)減少）2種影響，具體效應(yīng)因品種而異［21，22］。試驗(yàn)中太空誘變明顯促進(jìn)了根尖細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)，有絲分裂指數(shù)高于對(duì)照。細(xì)胞分裂指數(shù)體現(xiàn)了細(xì)胞分裂能力，該能力是否會(huì)影響幼苗及后期生長(zhǎng)需進(jìn)一步研究。

3.3 太空誘變對(duì)羊草細(xì)胞核及染色體畸變的影響

細(xì)胞微核是由染色體受損后形成的斷片或紡錘體受損丟失的整條染色體形成，具有可遺傳性，是衡量染色體誘變損傷的可靠指標(biāo)［23］。研究表明，經(jīng)太空誘變后羊草根尖細(xì)胞出現(xiàn)了微核和雙微核2種核畸變類型，說(shuō)明衛(wèi)星搭載使羊草細(xì)胞發(fā)生了變異，這種變異可作為羊草空間誘變遺傳育種的重要理論依據(jù)。

染色體是遺傳信息的載體，染色體變異必然導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生，是生物遺傳變異的重要來(lái)源，以染色體畸變率作為檢測(cè)誘變?cè)吹纳镄?yīng)和遺傳效應(yīng)的指標(biāo)是比較直接［24］。羊草經(jīng)空間搭載后其根尖細(xì)胞染色體出現(xiàn)染色體單橋、斷片、雙橋、游離染色體、落后染色體、染色體斷片、染色體粘連等多種畸變類型。針對(duì)染色體變異類型能否在后代植株中表達(dá)、如何表達(dá)以及是否出現(xiàn)優(yōu)異突變體等將會(huì)成為今后研究的重點(diǎn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，太空誘變處理對(duì)羊草種子的萌發(fā)能力影響不大，但能夠促進(jìn)羊草種子根尖細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞核和染色體發(fā)生變異。

［1］ 薛淮，劉敏.植物空間飛行的生物效應(yīng)及其育種研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)通報(bào)，2002，37（11）：7－8.

［2］ 賈建航，王斌.空間飛行育種研究進(jìn)展［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，1999，13（3）：187－192.

［3］ 郝愛(ài)平，詹亞光，尚潔.誘變技術(shù)在植物育種中的研究新進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2004（6）：30－34.

［4］ 賈淑芹，王得亮.大豆空間誘變育種的研究，中國(guó)宇航學(xué)會(huì)［C］//航天育種論文集.北京：中國(guó)科技技術(shù)出版社，1995，116－120.

［5］ 蔣興邨，李金國(guó)，陳芳遠(yuǎn)，等.“8885”返地衛(wèi)星搭載對(duì)水稻種子遺傳性的影響［J］.科學(xué)通報(bào)，1991，36（23）：1820－1824.

［6］ 李東芳，倪丕沖，沈桂芳.水稻航天誘變育種及其機(jī)理研究的進(jìn)展與展望［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2004，7（6）：1－2.

［7］ 劉錄祥，郭會(huì)君，趙林姝.我國(guó)作物航天育種20年的基本成就與展望［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21（6）：589－592.

［8］ 馮鵬，劉榮堂，張?zhí)N薇.分子標(biāo)記技術(shù)在植物空間誘變育種機(jī)理研究中的應(yīng)用［J］.草原與草坪，2008（2）：1－5.

［9］ 胡化廣，劉建秀，郭海林，等.我國(guó)植物空間誘變育種及其在草類植物育種中的應(yīng)用［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，1（15）：15－21.

［10］ 韓蕾，孫振元，錢永強(qiáng)，等.神舟三號(hào)飛船對(duì)草地早熟禾生物學(xué)特性的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，21（4）：17－19.

［11］ 張文娟，陳本建，鄧波，等.空間搭載對(duì)2個(gè)紫花苜蓿品種過(guò)氧化物酶同功酶的影響［J］.草原與草坪，2011，31（3）：85－88.

［12］ 杜周和，左艷春，朱永群，等.實(shí)踐八號(hào)育種衛(wèi)星搭載高丹草種子發(fā)掘有益突變體［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，25（4）：0627－0632.

［13］ 劉麗，唐鳳蘭，張?jiān)聦W(xué)，等.空間飛行和60Co－γ射線輻照對(duì)苦荬菜種子的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2007，15（5）：469－472.

［14］ 范潤(rùn)鈞，陳本建，鄧波，等.航天搭載紫花苜蓿SSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化以及引物的篩選［J］.草原與草坪，2008，30（2）：22－26.

［15］ 馬鶴林，王夢(mèng)龍.輪回選擇法在羊草育種中的應(yīng)用［J］.內(nèi)蒙古草業(yè)，1997（2）：51－53.

［16］ 王克平，婁玉杰，成文革.吉生羊草營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2005，24（8）：24－27.

［17］ 張志良.植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）［M］.北京：高等教育出版社，1999：259－260.

［18］ 徐云遠(yuǎn)，賈敬芬，牛炳韜.空間條件對(duì)3種豆科牧草的影響［J］.空間科學(xué)學(xué)報(bào)，1996，16（增刊）：136－141.

［19］ 胡向敏，云錦鳳，高翠萍.“實(shí)踐八號(hào)”衛(wèi)星搭載對(duì)蒙農(nóng)雜種冰草生物學(xué)特性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：946－948.

［20］ 易津.賴草屬牧草種子休眠與植物激素調(diào)控［J］.草地學(xué)報(bào)，1997，5（2）：93－99.

［21］ 任衛(wèi)波，徐柱，陳立波，等.紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后其根尖細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（5）：566－568.

［22］ 謝琳，牛應(yīng)澤，郭世星.航天搭載與NaN3處理對(duì)甘藍(lán)型油菜根尖細(xì)胞的誘變效應(yīng)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（12）：4250－4256.

［23］ Maki P J，Hauashi M，Suzukit，et al.Analysis by fluorescence in situ hybridization with a mouse gamma satellite DNA probe of isolated micronuclei induced in mice by two clastogens and two spindle poinson［J］.Mutagenesis，1995，10（6）：513－519.

［24］ 劉錄祥，韓微波，郭會(huì)君，等.高能混合粒子場(chǎng)誘變小麥的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究［J］.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，19（5）：327－331.