楊 成，高云星，董 群

(皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

斜鏈擬青霉(Paecilomyces cateniobliquus)，一種重要的蟲生真菌，多寄生于茶卷葉蛾、茶小卷葉蛾，與細(xì)腳擬青霉、蟬擬青霉、冬蟲夏草的無性型中國擬青霉同屬擬青霉屬真菌。細(xì)腳擬青霉、蟬擬青霉、冬蟲夏草對機(jī)體免疫功均具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)活性［1－4］，而目前，斜鏈擬青霉的研究和應(yīng)用多集中在生物防治［5］，有關(guān)其藥理活性方面的研究報(bào)道尚少［5］。本實(shí)驗(yàn)擬就斜鏈擬青霉胞外多糖對環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)致免疫力抑制的小鼠模型進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，研究胞外多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和來源 斜鏈擬青霉(Paecilomyces cateniobliquus)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蒸餾水1 000 ml。

1.1.3 藥品和試劑 環(huán)磷酰胺(購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:07011421)，LPS(購自Sigma公司)，小鼠IL-12檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所，批號:080612)，RPMI1640完全培養(yǎng)液(購自GIBCO)，其他均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物 昆明系小鼠30只，(18～22)g，雌雄各半，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:Scxk(蘇)2008-0010。

1.2 方法

1.2.1 斜鏈擬青霉胞外多糖制備 采用上述SDAY液體培養(yǎng)基，以10%的接種量接入一級液體種子，置28℃真菌培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)25 d后抽濾，取濾液低溫減壓濃縮至原體積的1/4，加無水乙醇4℃冰箱過夜進(jìn)行分級醇沉，終濃度梯度為30%→50%→75%，離心，取沉淀凍干后備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 參考文獻(xiàn)［7－8］，實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)環(huán)境一周后隨機(jī)分組，6只小鼠作為正常組，剩余24只小鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，連續(xù)3 d建立免疫抑制模型，造模后隨機(jī)分成4組，其中3組作為實(shí)驗(yàn)組，從第2天開始分別腹腔注射低、中、高劑量斜鏈擬青霉胞外多糖(100 mg/kg、300 mg/kg、900 mg/kg)，作為模型對照組和正常組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥7 d。末次給藥12 h后斷頸處死，稱量體質(zhì)量，無菌分離脾臟，稱重，計(jì)算脾臟濕質(zhì)量指數(shù)。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定 處死前30 min，每鼠腹腔注射10%雞紅細(xì)胞生理鹽水溶液0.5 ml/只，注射后30 min脫頸椎處死小鼠，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 ml，輕揉小鼠腹部1 min，腹部剪一小孔，吸取腹腔液后滴于2片載玻片上并分別推片，放入墊有溫紗布的搪瓷盆內(nèi)，37℃水溫，30 min后，生理鹽水漂洗，丙酮∶甲醛為1∶1固定，4%Giemsa磷酸緩沖液染色5 min，鏡下計(jì)數(shù)并計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞懸液的制備和計(jì)數(shù) 無菌取出小鼠脾臟，置于盛有5 ml無Ca2+、Mg2+Hank's液平皿中的100目銅網(wǎng)上，常規(guī)研磨制備單細(xì)胞懸液，800 r/min，離心 10 min，經(jīng) Tris-NH4Cl去除紅細(xì)胞，Hank's液洗滌3遍，臺盼蘭染色，鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)＞90%。用RPMI1640完全培養(yǎng)液配成2×106/ml脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

1.2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性測定 取上述1.2.4分離制備的脾淋巴細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔分別加入不同組小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液100μl，再加入100μl LPS溶液(終濃度6μg/ml)，每組各3復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔收集培養(yǎng)上清液100μl備用。然后每孔加入MTT(5 mg/m l)20μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h，離心棄去上清，每孔加入0.08 mol/L鹽酸異丙醇100μl，充分震蕩后，靜置20 min，酶標(biāo)儀570 nm測定OD值，計(jì)算每組淋巴細(xì)胞增殖率。

1.2.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-12活性測定 取上述1.2.5中獲得的各組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時收集上清液100μl，用ELISA試劑盒測定IL-12含量，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書程序進(jìn)行。在酶標(biāo)儀上測定450 nm處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)間采用F檢驗(yàn)，多組均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 斜鏈擬青霉胞外多糖對CP致免疫抑制小鼠免疫器官濕質(zhì)量指數(shù)的影響 從表1結(jié)果可知:模型組小鼠脾臟濕質(zhì)量指數(shù)明顯低于正常組，說明CP對小鼠免疫功能起到一定的抑制作用。經(jīng)F檢驗(yàn)，各組間存在差異(P＜0.01)。組間兩兩比較，高劑量組與正常組相比，差異也顯著(P＜0.05)。

2.2 斜鏈擬青霉胞外多糖對CP致免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 從表1中可以看出，與模型組比較，多糖給藥實(shí)驗(yàn)組均可不同程度地提高CP致免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，經(jīng)方差分析，各組間差異顯著(P＜0.05)。但多糖給藥組與正常組比較，差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 斜鏈擬青霉胞外多糖對CP致免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 從表1中看出，與模型組相比，正常組和給藥組小鼠B淋巴細(xì)胞增殖活性明顯偏高，F(xiàn)檢驗(yàn)，各組間差異顯著(P＜0.05);而正常組與給藥組之間，多糖高劑量組和中劑量組對B淋巴細(xì)胞增值活性刺激最為明顯，高劑量給藥組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 斜鏈擬青霉胞外多糖對CP致免疫抑制IL-12水平的影響 由表1可見，高、中劑量給藥組小鼠IL-12濃度與模型組、正常組之間比較，經(jīng)方差分析，各組間存在明顯的差異(P＜0.01)。低劑量給藥組、生理鹽水正常組與模型組之間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明斜鏈擬青霉胞外多糖可提高CP致免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞分泌IL-12的水平，且存在一定量效關(guān)系。

表1 各實(shí)驗(yàn)組脾臟濕質(zhì)量指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)、B淋巴細(xì)胞增殖活性、IL-12水平比較(±s，n=6)Tab1 Comparison of wet weight index of spleen，macrophages phagocytosis，activity of B lymphocyte proliferation and IL-12 level among groups

表1 各實(shí)驗(yàn)組脾臟濕質(zhì)量指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)、B淋巴細(xì)胞增殖活性、IL-12水平比較(±s，n=6)Tab1 Comparison of wet weight index of spleen，macrophages phagocytosis，activity of B lymphocyte proliferation and IL-12 level among groups

與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與正常組比較:△P ＜0.05，△△P ＜0.01*P ＜0.05 and ＊＊P ＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 and △△P ＜0.01 vs normal group

組別 劑量(mg/kg)脾臟濕質(zhì)量指數(shù)(mg/g) 吞噬率(%) 吞噬指數(shù)B淋巴細(xì)胞活性(ODA570nm)IL-12(ng/L)正常組－ 5.139±0.428＊＊ 61.196±5.064* 0.640±0.216*＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 0.337 ±0.058 2.316 ±0.468模型組 100 3.672 ±0.438 35.995 ±15.235 0.311 ±0.059 0.302 ±0.074 2.193 ±0.111實(shí)驗(yàn)組 100 5.062 ±0.712＊＊ 38.032 ±16.692 0.480 ±0.199 0.316 ±0.074 2.515 ±0.201 300 5.475 ±0.613＊＊ 42.928 ±14.634* 0.546 ±0.254* 0.342 ±0.044 3.250 ±1.040＊＊△△900 6.258 ±0.944＊＊△ 56.112 ±12.284* 0.601 ±0.047* 0.431 ±0.054＊△ 4.080 ±0.320＊＊△△F 值 12.271 4.181 3.181 3.874 12.847 P值

3 討論

真菌多糖作為安全低毒的免疫調(diào)節(jié)劑，因具有激活多種免疫細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以斜鏈擬青霉胞外多糖為研究對象，從脾濕質(zhì)量指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖及其分泌IL-12等方面對其免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果上述四項(xiàng)指標(biāo)均增加，說明斜鏈擬青霉胞外多糖不僅能夠激活免疫抑制小鼠的巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，而且也能激活適應(yīng)性淋巴細(xì)胞，提高其細(xì)胞因子的分泌水平。作為機(jī)體重要的外周免疫器官脾臟，含大量免疫細(xì)胞，對于健康小鼠其濕質(zhì)量指數(shù)的增加從一個側(cè)面表明其內(nèi)免疫細(xì)胞大量的分化增殖。巨噬細(xì)胞作為重要的多功能的免疫細(xì)胞，廣泛分布于機(jī)體多種組織器官，正常情況下，處于休眠態(tài)，一旦被激活將發(fā)揮吞噬殺菌、抑制腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能。作為淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及其分泌的IL-12同樣是機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，淋巴細(xì)胞增殖活性的提高直接表明機(jī)體適應(yīng)性免疫能力的提高［9］，而其分泌的IL-12是一種主要的T細(xì)胞生長因子，激活的T細(xì)胞，也可以促進(jìn)B細(xì)胞中免疫球蛋白的合成和J鏈的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)LAK細(xì)胞的殺傷活性［10－11］。綜上所述，斜鏈擬青霉胞外多糖對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)活性，可認(rèn)為斜鏈擬青霉不僅可以作為生防菌，而且也可以作為藥用真菌具有進(jìn)一步應(yīng)用的潛力。

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