莆田市環(huán)境監(jiān)測站 傅昶寧

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擬柱胞藻檢測技術(shù)改進

莆田市環(huán)境監(jiān)測站 傅昶寧

近年來，在我國各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻水華，由于其具有一定的毒性，而且發(fā)生水華時肉眼不易發(fā)現(xiàn)，同時爆發(fā)時，藻密度通常能達到每升上億個細胞。該文根據(jù)與其它藻類不同的特性，提出了擬柱胞藻檢測方法，通過對傳統(tǒng)檢測方法的改進，證明了其實用性、準確性和簡潔性。

擬柱胞藻 檢測 鑒定 改進

1 概述

擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，又名拉氏擬柱胞藻，為藍藻類原核生物念珠藻目念珠藻科柱胞藻屬。由于其在不同的環(huán)境下，形態(tài)變化較大，因此，在我國有中華尖頭藻和拉氏擬魚腥藻等多個名稱[1]。擬柱胞藻能夠產(chǎn)生Cylindrospermopsin（CYN）、麻痹性貝毒、類毒素-A等。其中CYN能導(dǎo)致肝腎損害，也有可能致癌，麻痹性貝毒和類毒素-A均為神經(jīng)毒素。據(jù)報道，在澳大利亞棕櫚島，有149人出現(xiàn)了肝腸炎癥狀，這與被擬柱孢藻所產(chǎn)生毒素污染的飲用水有較大相關(guān)性。擬柱孢藻在溫帶和熱帶地區(qū)的淺水水域（如湖泊、水庫等）生長良好，一旦形成水華，數(shù)目巨大，如美國印第安納州發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻的19個湖泊中，藻密度均達到每升上億個細胞[2]。近年來，在我國山東、湖北、廣東和云南等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了擬柱胞藻及其水華。

由于擬柱胞藻通常不在水體表面形成明顯的浮膜，根據(jù)近幾年對莆田市東圳水庫拉氏擬柱胞藻的上百次日常檢定發(fā)現(xiàn)，若待到發(fā)現(xiàn)水體顏色變?yōu)檩^為明顯的黃綠色，則藻密度至少在2×108個細胞/升以上。一旦水華爆發(fā)，其藻類數(shù)量將占藻類總數(shù)的98%以上。因此，擬柱胞藻的檢測方法，在對水庫、湖泊水質(zhì)的預(yù)警和水質(zhì)評價中具有十分重要的意義。

2 擬柱胞藻檢測現(xiàn)狀

由于擬柱胞藻是發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生毒素的最新藍藻種類，在國內(nèi)各項標準中均未見對擬柱胞藻的毒素或藻密度做出相關(guān)規(guī)定。在我國，福建、山東、湖北和云南等地發(fā)現(xiàn)了擬柱胞藻及其水華。本文在深入理解《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版增補版）中關(guān)于藻類檢測方法的基礎(chǔ)上進行了技術(shù)試驗，總結(jié)出鑒定擬柱胞藻并改進的快速檢測方法[3]。下面主要以莆田市東圳水庫的擬柱胞藻檢測為例進行說明。

3 擬柱胞藻檢測方法及改進介紹

3.1 儀器及試劑

奧林巴斯AX31顯微鏡，設(shè)備包括帶指示方框的10×目鏡，10×、20×、40×物鏡；

有機玻璃采水器；

分液漏斗；

0.1mL微量移液器；

50mL棕色標本瓶；

計數(shù)框：面積為20×20mm、容量為0.1mL，其內(nèi)劃分橫直各10行格，共100個小方格。

22mm×22mm蓋玻片；

魯哥氏液（Lugols solution）：稱取4g碘及6g碘化鉀，溶于100mL純水中，避光保存。

福爾馬林固定液：將4mL福爾馬林（40%）甲醛和10mL甘油溶于86mL純水中。

3.2 水樣的采集及固定

用有機玻璃采水器采集100～2000mL水樣（視水中藻密度大小適當增減采水量），采樣后及時加入1%體積的魯哥氏液固定。如需長期保存，再加入幾毫升福爾馬林固定液，密封保存。

3.3 沉淀和濃縮

由于擬柱胞藻細胞個體小，且一旦形成水華，數(shù)目巨大，故根據(jù)藻密度，對固定后的水樣進行不同的處理。

當藻密度較低，即每升濃度低于10萬個細胞時，將水樣充分搖勻后，取1000mL在分液漏斗中沉淀，沉淀時間須滿48小時。在計數(shù)時，取沉淀物約30毫升，定容至50毫升。

當擬柱胞藻每升濃度處于10萬～30萬個細胞時，無需沉淀和濃縮，可直接進行鑒定。

當藻密度大于每升30萬個細胞時，根據(jù)實際需要進行稀釋，并補充適量的魯哥氏液進行染色固定。

3.4 擬柱胞藻的鑒定和計數(shù)

由于擬柱胞藻藻絲不易斷裂，將計數(shù)樣品充分搖勻后，迅速吸取0.1mL樣品到計數(shù)框中，蓋上蓋玻片。計數(shù)框中應(yīng)無氣泡，也無樣品溢出。標本制成后，靜置幾分鐘，使藻體沉至框底，再進行鏡檢。

3.5 擬柱胞藻的鑒定

擬柱胞藻整條藻絲粗細均勻，藻絲通常寬2～3微米，長度變化較大，從10～120微米的都有。形態(tài)上，大部分為直線形，在某些地區(qū)會發(fā)現(xiàn)有卷曲形的[2]，有時可見異形胞。在其生長旺盛期，可見豐富的氣泡。擬柱胞藻的單個細胞長度范圍為3～10微米，由于其很少出現(xiàn)細胞收縮，故單個細胞往往很難區(qū)分。

圖1 直線型擬柱胞藻

圖2 卷曲形擬柱胞藻

圖3 直線型擬柱胞藻的異形胞

3.6 擬柱胞藻的計數(shù)

在東圳水庫，擬柱胞藻爆發(fā)期的藻密度通常在每升兩億個細胞以上，為了減少工作量，對傳統(tǒng)的計數(shù)方法進行了改進。

首先，根據(jù)擬柱胞藻的個體長度與細胞特性，計數(shù)時，顯微鏡目鏡使用10倍，物鏡使用20倍，依照目鏡行格法，間隔選取四個“半行格”（見圖4），先對藻絲的個體數(shù)進行統(tǒng)計。一個“半行格”內(nèi)的個體數(shù)目一般不少于100個。圖4所示方法有以下三個好處：第一，在10×20倍放大倍數(shù)下，每個視野的直徑剛好等于1mm，即等于面積為20×20mm劃分成100方格后，每個方格邊長的一半，單次橫向的十格次視野，剛好是1/2行格，較之10×20倍放大倍數(shù)，一次橫向檢測所計視野面積大了一倍，大大減少了工作量，加快檢測速度；第二，擬柱胞藻的藻絲長度在該放大倍數(shù)下，較為清楚，同時，由于擬柱胞藻含有豐富的偽空泡，沉淀時間不足的情況下，藻絲常會懸浮在水中，常常出現(xiàn)分層現(xiàn)象，故需要在鏡檢計數(shù)過程中，需要不斷調(diào)整焦距，比起使用10×40倍的放大倍數(shù)，減小了調(diào)整幅度，使計數(shù)更為輕松快捷，減緩視力疲勞；第三，取不同行格的上下位置計數(shù)，能夠較為均衡準確地統(tǒng)計總數(shù)，使統(tǒng)計結(jié)果更具代表性和準確性。

統(tǒng)計完個體數(shù)后，轉(zhuǎn)換使用40倍物鏡，隨機選取若干個不重復(fù)視野，統(tǒng)計各視野內(nèi)全部藻絲個體的細胞數(shù)和個體數(shù)，再進行換算。一般所參與此處統(tǒng)計的個體數(shù)不得少于30條。

由于擬柱胞藻很少出現(xiàn)細胞收縮，若按照傳統(tǒng)檢測方法，對細胞總數(shù)直接進行統(tǒng)計，工作量巨大，極大地影響了技術(shù)效率。每個樣品，各取樣和計數(shù)兩次，兩次結(jié)果與平均數(shù)之差應(yīng)不大于±15%，否則須繼續(xù)取樣計數(shù)。

圖4 計數(shù)板上四個“半行格”的計數(shù)方法

3.7 計算結(jié)果

每升水樣中擬柱胞藻的數(shù)量按下式計算：

N=A/Ac×Vs/Va·n （1）

根據(jù)以上計數(shù)方法，一個計數(shù)框共含10行格，實計數(shù)2行格，在擬柱胞藻密度較高時，未進行稀釋的情況下，則（1）～（2）式可簡化為：

N=5×104·n （4）

依（3）和（4）式計算出水樣中的擬柱胞藻含量，并根據(jù)（3）式所得的個體平均細胞數(shù)對水庫水質(zhì)未來幾日發(fā)展趨勢進行簡單的判定。

3.8 改進方法要點

第一，樣品中擬柱胞藻密度較低時，濃縮沉淀時間必須滿48小時。由于新鮮的擬柱胞藻富含偽空泡，固定時間不足的情況下，會有較多的細胞無法沉淀，從而導(dǎo)致濃縮后檢測結(jié)果偏小。

第二，在計數(shù)過程中，以計數(shù)框的四個“半行格”進行統(tǒng)計，不但不需要計算視野面積，無需配置臺尺和目尺，而且在充分體現(xiàn)了抽樣大小和代表性的情況下，通過實測兩行格的統(tǒng)計方式，大大減少了工作量，提升了工作效率。

第三，在日常藻類鑒定過程中，大多使用40倍物鏡進行計數(shù)統(tǒng)計，本文根據(jù)擬柱胞藻的個體長度及其在水華爆發(fā)時期會導(dǎo)致物種的多樣性和豐富性明顯下降[2]的特性，選擇使用20倍物鏡，不但可以清晰地看出擬柱胞藻的個體，同時還能在相同工作量下，增大計數(shù)面積，增加了統(tǒng)計結(jié)果的準確性和代表性。

第四，在計數(shù)方法上，不使用常規(guī)的按細胞計數(shù)，而是按照個體計數(shù)，再用個體總數(shù)乘以個體上的平均細胞數(shù)，來獲得統(tǒng)計數(shù)值。這樣做，既減少了由于藻細胞分隔不明顯，需要統(tǒng)計大量數(shù)值而容易出現(xiàn)的誤差和視覺疲勞，同時也極大加快了計數(shù)速度，及時有效地提供應(yīng)急監(jiān)測數(shù)據(jù)。而且，通過對個體上的藻體平均細胞數(shù)長期總結(jié)比較，根據(jù)擬柱胞藻的生長周期，可以在一定程度上對其未來幾日內(nèi)的發(fā)展趨勢進行預(yù)報，為水質(zhì)富營養(yǎng)化的預(yù)警提供了可能。

4 結(jié)語

經(jīng)典藻類檢測方法在用于擬柱胞藻的檢測時，非常費時，常常滯后于生產(chǎn)和研究，特別是在爆發(fā)期，極大地影響了對富營養(yǎng)化問題的分析決策。本方法經(jīng)過多次實驗后，證明了其實用、準確、簡潔等優(yōu)點，測試結(jié)果可較為迅速地得出，作為對擬柱胞藻富營養(yǎng)化的水體進行的檢測是高效、可行的。

[1] 查廣才,楊東娟,鄒海鷹.擬柱胞藻的營養(yǎng)成分與培養(yǎng)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,37(8):6-8.

[2] William W. Jones，Sarah Sauter. Distribution and Abundance of Cylindrospermopsis raciborskii in Indiana Lakes and Reservoirs[R]. SPEA-Indiana University，2005，4/5：1-41.

[3] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版增補版）[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,2002.