徐長(zhǎng)亮 綜述 劉志紅 審校

在對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制、診斷、生理功能及藥物開發(fā)研究中，往往需要獲取一些高通量、大樣本、全局性數(shù)據(jù)，通過整體化系統(tǒng)性分析，從中尋找線索，推斷可能的病因以及診斷靶標(biāo)，由此誕生了諸如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等建立在網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)式研究思路基礎(chǔ)上多種新的研究方法和理論。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，以其研究對(duì)象特殊性、研究方法專業(yè)性及研究思路系統(tǒng)性，已在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域和層面發(fā)揮獨(dú)特作用。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究尚處于初期階段，鑒于其特殊的研究方法及內(nèi)容，對(duì)揭示生命體尤其是疾病狀態(tài)下細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)具有不可替代的優(yōu)勢(shì)［1－4］。此外，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為尋找藥物新的作用靶點(diǎn)和疾病診斷指標(biāo)提供全新的研究思路。本文主要就磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)、藥學(xué)及醫(yī)學(xué)研究前景進(jìn)行綜述。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)概述

磷酸化是細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后最重要修飾形式之一，由蛋白激酶及磷酸酶參與，通過對(duì)蛋白底物可逆性磷酸化及去磷酸化調(diào)控生理過程，該過程高度保守。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的科學(xué)，包括氨基酸殘基磷酸化程度及細(xì)胞受刺激后動(dòng)態(tài)的蛋白磷酸化事件。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵性調(diào)控機(jī)制，幾乎參與細(xì)胞所有的生物學(xué)事件及細(xì)胞調(diào)控過程(如細(xì)胞周期、受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、細(xì)胞代謝等)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)正是利用電泳技術(shù)和質(zhì)譜相結(jié)合的手段實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)細(xì)胞中磷酸化蛋白的磷酸化程度進(jìn)行監(jiān)控的一種研究方法。

在信號(hào)傳導(dǎo)過程中，蛋白質(zhì)磷酸化通常扮演信號(hào)級(jí)聯(lián)開關(guān)的角色。一方面，受體蛋白酪氨酸激酶介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可啟動(dòng)時(shí)間依賴性細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化，該過程對(duì)其他銜接蛋白或者其他信號(hào)分子如蛋白激酶和磷酸化酶重新修飾，將信號(hào)傳導(dǎo)至下一級(jí)信號(hào)分子［5－8］。另一方面，蛋白磷酸化對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的衰減和終止同樣起重要作用，該控制系統(tǒng)失衡可能導(dǎo)致腎臟、心血管、自身免疫等多種疾病和腫瘤［9，10］。

盡管可用磷酸化位點(diǎn)特異性抗體通過普通或二維凝膠電泳檢測(cè)蛋白磷酸化，但識(shí)別新的磷酸化蛋白，尤其是尋找新磷酸化位點(diǎn)的過程更具挑戰(zhàn)性。除了檢測(cè)磷酸化豐度及位點(diǎn)，定量動(dòng)態(tài)地研究磷酸化事件對(duì)于認(rèn)識(shí)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也極其重要。另外，精密調(diào)控激酶和磷酸酶活性可導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)蛋白磷酸化水平發(fā)生微妙變化。某些信號(hào)蛋白的磷酸化不僅存在動(dòng)態(tài)變化，而且在細(xì)胞中還呈空間分布特點(diǎn)。與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)傳導(dǎo)蛋白磷酸化程度更多取決于外界刺激，如信號(hào)分子、藥物和機(jī)械壓力等。

因而，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)通過系統(tǒng)的回溯性研究，更加準(zhǔn)確和快速尋找激酶或磷酸化酶的源頭作用，然后結(jié)合經(jīng)典的生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，快捷地探索各種未知的生命奧秘。與此同時(shí)，隨著其他基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展與進(jìn)步，新技術(shù)、新儀器的不斷使用，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究也朝著更具特異性、再現(xiàn)性、重復(fù)性、靈敏性及精確性的方向發(fā)展［11］。

生物學(xué)領(lǐng)域

圖1 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)［13］

圖2 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

蛋白磷酸化在生命各個(gè)環(huán)節(jié)甚至在整個(gè)生命科學(xué)均起重要作用。截至2012年7月，Pubmed收錄關(guān)于磷酸化的文獻(xiàn)已經(jīng)超過16萬(wàn)篇，其中絕大多數(shù)涉及蛋白磷酸化。由于蛋白磷酸化研究的重要性，出現(xiàn)了跳出傳統(tǒng)經(jīng)典生物學(xué)，引申自“鳥槍法”為研究思路的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，是一種基于全細(xì)胞內(nèi)蛋白為研究靶標(biāo)，全蛋白水平掃描不同蛋白的磷酸化程度，尋找新的磷酸化蛋白及新磷酸化位點(diǎn)，不斷完善蛋白磷酸化體系，具有全面、可靠、高效及探索性的特點(diǎn)。首先，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以整個(gè)細(xì)胞所有蛋白為研究對(duì)象，研究?jī)?nèi)容囊括了細(xì)胞內(nèi)所有具有生命功能的蛋白，如細(xì)胞增生、細(xì)胞周期、有絲分裂、細(xì)胞分化等所有相關(guān)蛋白，因而研究更為全面。其次，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究基于全蛋白水平，因此其結(jié)果更具普遍性，而經(jīng)典生物學(xué)研究蛋白磷酸化往往針對(duì)特定條件，以兩個(gè)或多個(gè)蛋白之間的相互作用為出發(fā)點(diǎn)，具有相當(dāng)局限性，缺乏整體認(rèn)識(shí)，而磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)可一次性全面檢測(cè)不同蛋白激酶及磷酸化酶對(duì)同一個(gè)蛋白磷酸化程度的影響，因而結(jié)果更加可靠。再則，一次蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)可同時(shí)考慮蛋白磷酸化相關(guān)多個(gè)變量，了解同一時(shí)刻整個(gè)系統(tǒng)的變化。經(jīng)典生物學(xué)方法則只是了解單個(gè)研究變量(即目的變量)，不能反映細(xì)胞內(nèi)真實(shí)情況，逐步增加研究變量并借助更加復(fù)雜的研究系統(tǒng)，從而增加了研究的復(fù)雜性及不確定性，缺乏可重復(fù)性和真實(shí)性。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)反映的是細(xì)胞內(nèi)真實(shí)發(fā)生的事件，在一次試驗(yàn)中考慮了各種變量，克服了經(jīng)典生物學(xué)中逐步添加變量的缺陷，更為高效。最后，由于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，更易發(fā)現(xiàn)未知的新磷酸化位點(diǎn)及磷酸化蛋白。另外，結(jié)合經(jīng)典細(xì)胞生物學(xué)的知識(shí)，剔除已知蛋白激酶或者磷酸化酶影響，可發(fā)現(xiàn)新的具有磷酸化或去磷酸化功能的酶。

藥學(xué)領(lǐng)域

古人云“一石激起千層浪”，藥物就類似一塊石頭，當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)或作用于細(xì)胞后，其產(chǎn)生的各種生理效應(yīng)，就像“千層浪”一般，擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞甚至全身。如何找到藥物的作用機(jī)制，解答這種具有系統(tǒng)復(fù)雜性的問題，經(jīng)典實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法往往是從某個(gè)點(diǎn)出發(fā)，然后通過不同的技術(shù)手段，不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，不同的細(xì)胞生理活動(dòng)，希望通過還原論的觀點(diǎn)，以線性聯(lián)系，一步步推導(dǎo)出藥物作用的靶點(diǎn)，闡述藥物作用的機(jī)制［12］。由于各學(xué)科不斷發(fā)展，雖然產(chǎn)生了諸如分子模擬、同位素標(biāo)記、親和層析等新技術(shù)，以初步篩選、縮小研究范圍，但往往以點(diǎn)代面，必然會(huì)導(dǎo)致許多假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果。因而，就需要一種新的試驗(yàn)方法，全局性的觀察新問題。由此，便產(chǎn)生了一門新的藥理學(xué)科——網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)被廣泛的用于識(shí)別潛在的藥物靶點(diǎn)、預(yù)測(cè)其未知的適用范圍甚至檢測(cè)某些毒副反應(yīng)。適用范圍較傳統(tǒng)藥理學(xué)更大。由于蛋白的磷酸化在細(xì)胞生理功能及信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控中極其重要，目前許多藥物靶目標(biāo)都是與蛋白磷酸化相關(guān)的酶類，因此很多藥物的作用靶點(diǎn)都是這一類酶。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，由于其全蛋白質(zhì)組水平的磷酸化位點(diǎn)檢測(cè)的“網(wǎng)絡(luò)研究”特點(diǎn)，因此克服了傳統(tǒng)還原論“線性研究”缺陷，并結(jié)合已知的細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的知識(shí)，可更加快捷準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)藥物作用的潛在靶點(diǎn)，甚至做多靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，將更好地揭示藥物作用機(jī)制［13－15］。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)由于其自身的特點(diǎn)，必將成為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的一種重要的研究手段。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)生活質(zhì)量的追求也越來(lái)越高，需要威脅生命健康的各種疾病有更多更全面的認(rèn)識(shí)。隨著醫(yī)療理念的進(jìn)步，從傳統(tǒng)的重治療輕預(yù)防轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)防治療并重。隨著預(yù)防醫(yī)學(xué)的發(fā)展和完善，不同疾病的早期生物靶標(biāo)的尋找及鑒定已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)工作的重要任務(wù)。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)疾病生物靶標(biāo)，尤其磷酸化蛋白的生物靶標(biāo)的尋找具有不可替代的優(yōu)勢(shì)［16－23］。在各種疾病發(fā)病過程及藥物研究中起重要作用。因此，通過比較患者和正常人組織細(xì)胞代謝物中不同的蛋白磷酸化豐度，對(duì)于篩選疾病的診斷標(biāo)志物或者預(yù)后標(biāo)志物具有相當(dāng)重要的價(jià)值。同時(shí)，由于蛋白磷酸化是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過程，其對(duì)疾病治療藥物的使用也非常敏感，在個(gè)體化醫(yī)療的不斷發(fā)展與完善，對(duì)患者的磷酸化蛋白的研究可以更好的指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)臨床用藥的選擇。

目前，在腎臟病領(lǐng)域，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足的發(fā)展，對(duì)于研究各種激素及細(xì)胞因子對(duì)腎臟功能的改變發(fā)揮重要的推動(dòng)作用。例如，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究加壓素對(duì)髓袢升支粗段細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及集合管功能的影響［24－30］。另外也有研究涉及血管緊張素Ⅱ及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF－β)所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞功能及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［31－35］。同時(shí)，由于腎臟疾病可通過尿液監(jiān)測(cè)，因此Gonzales等［36］通過尿液外泌體磷酸化蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)新的蛋白磷酸化位點(diǎn)，其中包括噻嗪敏感性鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)serine－811的磷酸化位點(diǎn)這一個(gè)潛在生物靶標(biāo)。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白2(AQP2)的serine－256的磷酸化位點(diǎn)，而通過對(duì)該位點(diǎn)的磷酸化程度的檢測(cè)，可評(píng)估加壓素的活性程度，進(jìn)而監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程［37］。

因而，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)疾病生物靶標(biāo)的尋找，個(gè)性化治療方案的制定以及疾病進(jìn)展的監(jiān)測(cè)必將發(fā)揮更加重要的作用。

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)存在的問題

蛋白磷酸化在細(xì)胞內(nèi)通信中發(fā)揮極其重要生理功能，并在生命信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起著信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)放大的作用。參與細(xì)胞中多種生理過程，如細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞新陳代謝，細(xì)胞與細(xì)胞間的交流與溝通，并作出適當(dāng)反應(yīng)，對(duì)了解和監(jiān)控蛋白磷酸化意義重大。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)便順理成章的成為研究蛋白磷酸化最強(qiáng)有力的武器。由于磷酸化蛋白在生理活動(dòng)中所處的重要的地位，決定了磷酸化蛋白的豐度相對(duì)不足。為了解決這個(gè)問題需要從兩方面考慮:一是，提高儀器自身的靈敏度;二是，富集磷酸化蛋白。目前設(shè)備的功能尚不能滿足對(duì)生物樣本中極微量磷酸化蛋白分析的要求。因此，富集磷酸化蛋白肽段或體液樣品的就顯得尤為關(guān)鍵。目前，已經(jīng)有多種磷酸化蛋白富集方法，但都有不足之處。例如，特異性蛋白抗體免疫沉淀法，由于所用抗體對(duì)絲氨酸、蘇氨酸特異性較差，目前主要用于檢測(cè)酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。又如，固定金屬親和色譜層析法，雖然克服了免疫沉淀法的部分缺點(diǎn)，但可能會(huì)丟失一些低豐度未結(jié)合到層析柱的磷酸化肽段，但對(duì)多磷酸化的蛋白由于具有較強(qiáng)的親和力的蛋白卻很難被洗脫下來(lái)，同時(shí)柱上也會(huì)結(jié)合某些酸性基團(tuán)、電子供體也會(huì)結(jié)合到柱上，造成非磷酸化的污染。

另外，由于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是基于質(zhì)譜的研究，因而磷酸化肽段的序列分析和磷酸化位點(diǎn)的精確定位成為該研究的一個(gè)難點(diǎn)，因?yàn)榱姿峄亩闻c非磷酸化肽段在質(zhì)譜分析中先有不同的碎裂性。常規(guī)的數(shù)據(jù)分析處理軟件主要針對(duì)非修飾肽段進(jìn)行研究，當(dāng)使用于磷酸化肽段進(jìn)行處理時(shí)，其對(duì)序列分析的準(zhǔn)確性、靈敏度以及磷酸化位點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確性都具有很大的局限性。

最后，由于儀器、試劑和樣品的特殊性，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究要求消耗巨大的經(jīng)費(fèi)和資源。由于磷酸化蛋白在細(xì)胞總蛋白中的豐度較低，只占總蛋白的10%的樣品來(lái)源相對(duì)較難。因此每次實(shí)驗(yàn)樣本，需要提取大量的蛋白，一方面增加了實(shí)驗(yàn)本身的系統(tǒng)誤差;另一方面也增加了人力消耗。其次，磷酸化蛋白的標(biāo)記成本較高，由于目前廣泛使用的iTRAQ法靈敏度高，但是該法所需要的試劑價(jià)格昂貴。另外，為了保證盡量覆蓋所有蛋白譜，往往需要根據(jù)電荷情況將磷酸化蛋白樣品重新分布，而每一個(gè)組分都要作為一個(gè)單獨(dú)樣品，單獨(dú)標(biāo)記，進(jìn)一步增加了研究的經(jīng)費(fèi)投入。

小結(jié):磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究處于初級(jí)階段，尚有諸多不足之處，但是隨著研究的不斷開展，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷成熟，儀器設(shè)備不斷更新，我們有理由相信磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)必將在未來(lái)的生命科學(xué)研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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