施 艷，孫 虎，孫炳劍，王振躍

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所，河南鄭州450002)

甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)是馬鈴薯Y病毒屬的成員之一，已有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)抑制性消減雜交和基因芯片技術(shù)研究寄主對(duì)甘蔗花葉病毒的抗性［1］以及SCMV抗性基因的定位［2，3］.已有研究通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)研究了病毒侵染后玉米寄主基因的差異表達(dá)，并且克隆了其中一個(gè)病毒侵染后誘導(dǎo)表達(dá)的基因玉米硫氧還蛋白M2，發(fā)現(xiàn)玉米硫氧還蛋白 M2對(duì) SCMV的侵染是起到抑制作用的.硫氧還蛋白是一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量約為12 kD的小蛋白.所有的硫氧還蛋白都具有一個(gè)保守的活性中心，Trp-Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys，活性中心中的這2個(gè)半胱氨酸起到氧化還原作用［4］.隨著對(duì)植物中的硫氧還蛋白特別是擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的硫氧還蛋白研究的深入，硫氧還蛋白在植物中的許多重要作用也逐步顯示出來(lái)［5～10］，在水稻中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法敲除水稻硫氧還蛋白酶的表達(dá)，結(jié)果表明，水稻硫氧還蛋白酶在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中有至關(guān)重要的作用［11］.擬南芥硫氧還蛋白m3(Trxm3)主要存在于非綠色組織的質(zhì)體內(nèi)，通過(guò)基因突變發(fā)現(xiàn)Trxm3與胞間連絲的調(diào)控有關(guān)，Trxm3突變的植株中胞間連絲的分支增多并且胼胝質(zhì)的積累也加強(qiáng)［12］.為了成功建立侵染，病毒通過(guò)利用寄主因子來(lái)幫助它進(jìn)行復(fù)制和移動(dòng).在病毒侵染的不同階段，許多參與寄主新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及防衛(wèi)反應(yīng)的基因的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生變化［13～15］，因此，研究病毒侵染后寄主差異表達(dá)的基因?qū)⒂兄诹私獠《镜那秩緳C(jī)制.本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了SCMV侵染后的不同階段玉米硫氧還蛋白M1和M3表達(dá)水平的變化，分析玉米中不同硫氧還蛋白M與SCMV侵染的相關(guān)性，為進(jìn)一步深入研究玉米硫氧還蛋白M的在抗病毒反應(yīng)中的機(jī)制提供證據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

以玉米(Zea mays L.)品種綜31為試驗(yàn)材料.

1.2 病毒接種與葉片采集

在人工氣候室種植玉米品種綜31，待玉米長(zhǎng)到三葉期選擇長(zhǎng)勢(shì)好，生長(zhǎng)狀態(tài)一致的玉米幼苗分別接種對(duì)照0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(phosphate buffer，PB)和甘蔗花葉病毒(SCMV)侵染的玉米汁液.

接種后 2，6，10，14 d，分別采取對(duì)照接種和SCMV接種的玉米的第1片系統(tǒng)葉，接種后8 d系統(tǒng)葉片上可以觀(guān)察到花葉癥狀.

1.3 玉米的RNA提取與cDNA合成

利用 Trizol提取總 RNA，利用 TaKaRa的DNase進(jìn)行總RNA處理，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用微量分光光度計(jì)Nanodrop檢測(cè)RNA的含量和純度.每個(gè)樣品取0.5 μg總RNA進(jìn)行第1鏈cDNA合成，方法參照Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明進(jìn)行.

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的Trm序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Real-time PCR的內(nèi)參引物和目的片段引物，引物序列見(jiàn)表1.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

Real time PCR應(yīng)用ABI 7500擴(kuò)增儀的操作方法.按照 TAKARASYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)的方法操作，反應(yīng)條件如下:94℃，30 s;94 ℃，5 s;58 ℃，20 s;72 ℃，35 s.40個(gè)循環(huán).

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，用SAS8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性測(cè)驗(yàn)在0.05水平進(jìn)行.

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米總RNA質(zhì)量分析及cDNA第1鏈合成

利用Trizol提取總RNA，通過(guò)微量分光光度計(jì)Nanodrop檢測(cè)RNA的濃度和純度(表2).由表2可見(jiàn)，紫外吸光值A(chǔ)260/A280的比值均為1.8～2.0，表明提取的總RNA的純度較高，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)RNA條帶清晰，沒(méi)有拖帶現(xiàn)象，表明提取的總RNA的純度和完整性較好，可以用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析.

表2 玉米總RNA純度和質(zhì)量濃度Table 2 Purity and concentration of total RNAmg·L-1

圖1 玉米總RNA瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agrose gel analysis of total RNA in maize

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量體系的建立

玉米硫氧還蛋白M1(ZmTrm1)在模板量為2.5 mg·L-1時(shí)，退火溫度為58℃時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct值為22，介于15～30，表明有良好的擴(kuò)增，融解曲線(xiàn)只有單一的融解峰，表明ZmTrm1是特異性擴(kuò)增.玉米硫氧還蛋白 M3(ZmTrm3)在模板量為25 mg·L-1時(shí)，擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct值為24，融解曲線(xiàn)顯示單一的融解峰，表明ZmTrm3也是特異性擴(kuò)增(圖2).

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的融解曲線(xiàn)Fig.2 Melting curve of real-time PCR

2.3 SCMV侵染后不同階段ZmTrm1和ZmTrm3表達(dá)水平分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ZmTrm1在SCMV接種后2，6，10和14 d的表達(dá)水平.從圖3和圖4可以看出，在接種后2，6和10 d，SCMV接種葉片與對(duì)照接種葉片ZmTrm1和ZmTrm3表達(dá)水平差異不顯著，P值均 ＞0.05，在接種后 14 d，SCMV接種的葉片中的ZmTrm1和ZmTrm3表達(dá)水平顯著下降.

3 討論

硫氧還蛋白通過(guò)調(diào)控二硫鍵的氧化還原作用于一系列的靶標(biāo)蛋白，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，已有報(bào)道表明，硫氧還蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)的維生素合成、蛋白折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解以及淀粉降解等過(guò)程［16～18］，此外，楊樹(shù)中的葉綠體硫氧還蛋白 m調(diào)控的過(guò)氧化物氧化酶參與了病菌的防衛(wèi)反應(yīng)［19］.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR已被廣泛地應(yīng)用于功能基因表達(dá)的定量分析［20］，本研究采用SYBR Green I隨機(jī)摻入法是根據(jù)熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合后釋放熒光的特點(diǎn)而建立的一種實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，它的成本相對(duì)TaqMan探針?lè)ㄒ?，而且不需要探?由于SYBR Green結(jié)合DNA雙鏈?zhǔn)欠翘禺愋越Y(jié)合，因此非特異性擴(kuò)增可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究通過(guò)對(duì)擴(kuò)增的融解曲線(xiàn)的分析可以發(fā)現(xiàn)，只有單一的融解峰，因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物保證了PCR擴(kuò)增的特異性以及相對(duì)定量的可靠性.

ZmTrm1和ZmTrm3的表達(dá)水平在SCMV接種后2，6，10 d與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，而在接種后14 d ZmTrm1和ZmTrm3的表達(dá)水平顯著降低，兩者受病毒調(diào)控表達(dá)水平的變化不同與ZmTrm2表達(dá)水平的變化.已有研究表明，ZmTrm2在接種后10 d顯著上調(diào)表達(dá)，對(duì) SCMV的侵染起到抑制作用［21］，而 ZmTrm1和 ZmTrm3 在接種后 10 d 表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，只是在SCMV侵染后期表達(dá)水平要顯著下降，這可能是由于病毒侵染后期，葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)遭受破壞，光合作用變?nèi)跛鸬?硫氧還蛋白M是一種定位于葉綠體中，通過(guò)光調(diào)節(jié)碳代謝途徑發(fā)揮作用，因此葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞可能會(huì)影響硫氧還蛋白M的表達(dá).硫氧還蛋白是一類(lèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，不同的硫氧還蛋白M在病毒侵染的過(guò)程中發(fā)揮了不同的作用，本研究發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白M1和M3在SCMV侵染的后期表達(dá)水平顯著降低，通過(guò)影響防衛(wèi)反應(yīng)途徑的相關(guān)靶標(biāo)蛋白發(fā)揮作用，從而間接地影響病毒侵染.

［1］ SHI C，THüMMER F，MELCHINGER A E，et al.Comparison of transcript profiles between near-isogenic maize lines in association with SCMV resistance based on unigene-microarrays［J］.Plant Sci，2006，170:159-169.

［2］ XIA X C，MELCHINGER A E，KUNTZE L，et al.Quantitative trait loci mapping of resistance to sugarcane mosaic virus in maize ［J］.Phytopathology，1999，89(8):660-667.

［3］ DUSSLE C M，MELCHINGER A E，KUNTZE L，et al.Molecular mapping and gene action of Scm1 and Scm2，two major QTL contributing to SCMV resistance in maize［J］.Plant Breed，2000，119(4):299-303.

［4］ HOLMGREN A.Thioredoxins［J］.Annu Rev Biochem，1985，54:237-271.

［5］ ISHIWATARI Y，HONDA C，KAWASHIMA I，et al.Thioredoxin h is one of the major proteins in rice phloem sap［J］.Planta，1995，195:456-463.

［6］ RIVERA-MADRID R，MESTRES D，MARINHO P，et al.Evidence for five divergent thioredoxin h sequences in Arabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:5620-5624.

［7］ MEYER Y，VIGNOLS F，REICHHELD J P.Classification of plant thioredoxins by sequence similarity and intron position［J］.Methods Enzymol，2002，347:394-402.

［8］ MEYER Y，REICHHELD J P，VIGNOLS F.Thioredoxins in Arabidopsis and other plants［J］.Photosyn Res.2005，86:419-433.

［9］ GELHAYE E，ROUHIER N，GéRARD J，et al.A specific form of thioredoxin h occurs in plant mitochondria and regulates the alternative oxidase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:14545-14550.

［10］ JUáREZ-DIAZ J A，MCCLURE B，VáZQUEZ-SANTANA S，et al.A novel thioredoxin h is secreted in Nicotiana alata and reduces S-RNase in vitro［J］.J Biol Chem，2006，281:3418-3424.

［11］ CHI Y H，MOON J C，PARK J H，et al.Abnormal chloroplast development an growth［X1］inhibition in rice thioredoxin m［X2］knock-down plants［J］.Plant Physiol，2008，148:808-817.

［12］ BENITEZ-ALFONSO Y，CILIS M，ROMAN A S，et al.Control of Arabidopsis meristem development by thioredoxin-dependent regulation of intercellular transport［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106:3615-3620.

［13］ COLLAZO C，RAMOS P L，CHACóN O，et al.Phenotypical and molecular characterization of the Tomato mottle Taino virus-Nicotiana megalosiphon interaction［J］.Physiol Mol Plant Pathol，2006，67:231-236.

［14］ ESCALETTES S V，HULLOT C，WAWRZY＇NCZAK D，et al.Plum pox virus induces differential gene expression in the partially resistant stone fruit tree Prunus armeniaca cv.Goldrich ［J］.Gene，2006，374:96-103.

［15］ ALFENAS-ZERBINI P，MARIA I G，F(xiàn)áVARO R D，et al.Genome-wide analysis of differentially expressed genes during the early stages of tomato infection by a potyvirus［J］.Mol Plant-Microbe Interact，2009，22:352-361.

［16］ BALMER Y，KOLLER A，DEL VAL G，et al.Proteomics gives insight into the regulatory function of chloroplast thioredoxins［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100:370-375.

［17］ BARTSCH S，MONNET J，SELBACH K，et al.Three thioredoxin targets in the inner envelope membrane of chloroplasts function in protein import and chlorophyll metabolism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105:4933-4938.

［18］ MOTOHASHI K，KONDOH A，STUMPP M T，et al.Comprehensive survey of proteins targeted by chloroplast thioredoxin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:11224-11229.

［19］ ROUHIER N，GELHAYE E，GUALBERTO J M，et al.Poplar peroxiredoxin Q a thioredoxin-linked chloroplast antioxidant functional in pathogen defense［J］.Plant Physiol，2004，134:1027-1038.

［20］ HEID C A，STEVENS J，LICAK K J，et al.Real Time quantitative PCR ［J］.Genome Res，1996，6(10):986-994.

［21］ SHI Y，QIN Y，CAO Y Y，et al.Influence of an type thioredoxin in maize on potyviral infection［J］.Euro J Plant Pathol，2011，131(2):317-326.