李海霞，孫金花，郭志民，胡彥民

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，用含有適當(dāng)抗生素或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基可篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞.目前，多以草丁膦和潮霉素進(jìn)行篩選［1，2］，前人對(duì)二者的適宜劑量進(jìn)行了大量研究，但是，研究時(shí)所用的試驗(yàn)指標(biāo)多局限愈傷組織存活的范疇［1，3，4］，而有關(guān)抗生素對(duì)玉米愈傷組織再生影響的研究較少.不同的抗性標(biāo)記基因所適用的抗生素種類(lèi)不同，不同的材料所用的適宜濃度也有不同.遺傳霉素(G418)和卡那霉素(Kan)是常用的抗生素，且價(jià)格低廉.本研究利用這2種抗生素，對(duì)玉米愈傷組織生長(zhǎng)和再生兩方面的影響進(jìn)行了研究，以期篩選出適合玉米愈傷組織的抗生素劑量，同時(shí)也對(duì)抑菌劑頭孢霉素(Cef)進(jìn)行了研究，以求在轉(zhuǎn)化后能最大程度地減小對(duì)愈傷的傷害.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用玉米自交系87－1和雜交種87－1×鄭22、齊319×87－1、鄭22×P2、87－1×齊319、昌7－2×HiⅡA等繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織為材料.

1.2 基本培養(yǎng)基

繼代培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L－12，4 － D+700 mg·L－1脯氨酸 +500 mg·L－1水解酪蛋白 +30 g·L－1蔗糖.

分化培養(yǎng)基:N6+1.0 mg·L－16 － BA+1.0 mg·L－1KT+700 mg·L－1脯氨酸 +500 mg·L－1水解酪蛋白+30 g·L－1蔗糖.

預(yù)處理培養(yǎng)基:N6+700 mg·L－1脯氨酸+500 mg·L－1水解酪蛋白 +30 g·L－1蔗糖

1.3 方法

1.3.1 卡那霉素敏感性測(cè)定的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將繼代培養(yǎng)的齊319×87－1、鄭22×P2的愈傷組織切成2 mm大小塊狀，分別轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度Kan的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)基設(shè)卡那霉素質(zhì)量濃度0(CK)，3，6，10，15，20 mg·L－16 個(gè)處理(抗生素過(guò)濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后，冷卻到60℃時(shí)加入抗生素，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿).每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20塊愈傷組織，每次接種到抗性培養(yǎng)基時(shí)，稱(chēng)量初始愈傷的重量，2周后稱(chēng)量愈傷組織終重，計(jì)算愈傷組織的平均生長(zhǎng)量，其間觀察愈傷組織的形態(tài)與特征.第1次抗性處理后一部分繼續(xù)進(jìn)行第2次卡那霉素繼代處理，質(zhì)量濃度處理同第1次卡那霉素處理一樣，設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20塊愈傷組織;另一部分先進(jìn)行分化預(yù)處理后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化處理，設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10塊愈傷組織.置于光下培養(yǎng)，光照時(shí)間為 16 h·d－1，光照度 2 500 ～3 000 lx，培養(yǎng)溫度為26℃，每周統(tǒng)計(jì)1次綠色愈傷率、再生苗率、生根率和褐變率.2次卡那霉素繼代處理后的愈傷全部轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行再生試驗(yàn).

平均生長(zhǎng)量=(初始愈傷質(zhì)量－愈傷終質(zhì)量)/初始愈傷質(zhì)量

再生苗率=(出苗的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100%

生根率=(生根的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100%

褐變率=(褐變的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100%

1.3.2 G418敏感性測(cè)定的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)先將87－1，87－1×鄭22的愈傷組織進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度分別為 0(CK)，15，25，35，45，55，70 mg·L－1的 G418.基因型87－1處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，87－1×鄭22處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20塊愈傷組織.第1次抗性處理后各質(zhì)量濃度愈傷組織全部轉(zhuǎn)入分化預(yù)處理培養(yǎng)基，7 d之后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行再生試驗(yàn)，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10塊愈傷組織，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織平均生長(zhǎng)量、再生率、生根率、褐變率.

1.3.3 頭孢霉素對(duì)愈傷組織繼代及再生的影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)先將87－1×齊319、昌7－2×HiIIA的愈傷組織進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)基設(shè)頭孢霉素質(zhì)量濃度為0(CK)，100，200，300，400，500，600 mg·L－1，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放置20塊愈傷組織.第1次抗性處理后一部分進(jìn)行2次頭孢霉素繼代處理，質(zhì)量濃度處理同第1次頭孢霉素處理一樣，設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20塊愈傷組織;一部分進(jìn)行分化處理，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10塊愈傷.2次頭孢霉素繼代處理后的愈傷全部轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行再生試驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織平均生長(zhǎng)量、再生率、生根率、褐變率.

2 結(jié)果與分析

2.1 Kan對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及分化的影響

2個(gè)基因型的不同處理對(duì)Kan反應(yīng)較一致，當(dāng)Kan質(zhì)量濃度為3 mg·L－1時(shí)，各處理的愈傷組織平均生長(zhǎng)量均高于對(duì)照，其后，隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的平均生長(zhǎng)量基本上呈下降趨勢(shì).當(dāng)Kan質(zhì)量濃度大于6 mg·L－1時(shí)，Kan對(duì)第2次繼代處理愈傷組織平均生長(zhǎng)的抑制作用明顯大于第1次繼代愈傷組織的生長(zhǎng)(圖1).隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)抑制的強(qiáng)度，在不同基因型和不同繼代次數(shù)間存在明顯差異.

不同質(zhì)量濃度的Kan處理后對(duì)愈傷組織分化再生能力具有明顯的影響，隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的分化再生率呈明顯下降趨勢(shì)(圖2).但是，不同基因型和不同繼代處理次數(shù)的愈傷組織，對(duì)Kan敏感性存在較大差異，基因型鄭22×P2對(duì)Kan的敏感程度高于基因型齊319×87－1，Kan繼代1次對(duì)愈傷組織分化再生的影響程度明顯小于繼代2次的愈傷組織.

綜上所述，遺傳轉(zhuǎn)化中利用Kan篩選轉(zhuǎn)化體時(shí)，選用的質(zhì)量濃度不宜大于6 mg·L－1，且愈傷組織的篩選繼代次數(shù)不宜過(guò)多.

2.2 G418對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和分化的影響

對(duì)生長(zhǎng)在含有不同質(zhì)量濃度G418培養(yǎng)基中愈傷組織的平均生長(zhǎng)量，進(jìn)行了差異顯著性比較，結(jié)果列于表1.從表1中可以看出，培養(yǎng)基中添加G418后，愈傷組織的平均生長(zhǎng)量顯著低于對(duì)照，并且，隨著培養(yǎng)基中G418質(zhì)量濃度的增加，87－1和87－1×鄭22 2個(gè)基因型愈傷組織的平均生長(zhǎng)量呈顯著或極顯著的下降趨勢(shì).在相同的質(zhì)量濃度下，G418對(duì)2種基因型愈傷組織平均生長(zhǎng)量的影響無(wú)明顯差異.

G418對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)質(zhì)量也存在明顯影響，在不含有G418培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的愈傷組織，顏色鮮黃，富有光澤，組織塊呈顆粒狀，具有典型的胚性愈傷組織結(jié)構(gòu).在低質(zhì)量濃度G418培養(yǎng)基中的愈傷組織，顏色暗黃，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，組織塊顆粒狀不明顯;隨著G418質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的褐化程度加重，并呈水漬狀，胚性愈性組織明顯減少，當(dāng)G418質(zhì)量濃度大于45 mg·L－1時(shí)，愈傷組織褐化率均在70%以上(表2).G418對(duì)不同基因型愈傷組織生長(zhǎng)質(zhì)量的影響存在較大差異，在含有不同質(zhì)量濃度G418培養(yǎng)基中87－1愈傷組織的褐化率均高于87－1×鄭22的褐化率.

從表2可以看出，愈傷組織分化的結(jié)果.在含有G418培養(yǎng)基中愈傷組織的分化再生能力明顯低于對(duì)照，G418的質(zhì)量濃度大于55 mg·L－1時(shí)，繼代后的愈傷組織就完全褐化或呈水漬狀，失去了分化能力;G418的質(zhì)量濃度大于25 mg·L－1時(shí)，愈傷組織失去了產(chǎn)生再生苗的能力.G418對(duì)不同基因型愈傷組織分化再生能力的影響存在明顯差異，87－1×鄭22愈傷組織的分化再生能力高于87－1.

表1 不同質(zhì)量濃度G418處理愈傷組織平均生長(zhǎng)量差異顯著性比較Table 1 Difference comparison of growth amount with various concentration of G418 on 87－1

2.3 抑菌劑Cef對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及分化的影響

采用方差分析方法，對(duì)不同Cef質(zhì)量濃度下愈傷組織的生長(zhǎng)量，進(jìn)行了差異顯著性分析，采用t測(cè)驗(yàn)方法，對(duì)不同繼代次數(shù)間和不同基因型間愈傷組織的平均生長(zhǎng)量，進(jìn)行了差異顯著性分析，結(jié)果列于表3.從表3可以看出，基因型87－1×齊319用不同質(zhì)量濃度的Cef進(jìn)行第1次繼代處理后，僅有400 mg·L－1質(zhì)量濃度下愈傷組織的平均生長(zhǎng)量低于對(duì)照，其它處理間愈傷組織的平均生長(zhǎng)量均無(wú)明顯差異;第2次繼代處理后，100～400 mg·L－1處理的愈傷組織平均生長(zhǎng)量與對(duì)照無(wú)顯著差異，而在500，600 mg·L－1質(zhì)量濃度下愈傷組織的平均生長(zhǎng)量明顯低于對(duì)照.基因型昌7－2×HiIIA的愈傷組織，用不同質(zhì)量濃度的Cef兩次繼代處理后，僅有100 mg·L－1質(zhì)量濃度中愈傷組織的平均生長(zhǎng)量與對(duì)照無(wú)顯著差異，而其它處理的愈傷組織平均生長(zhǎng)量都小于對(duì)照.

表2 不同質(zhì)量濃度G418繼代后愈傷組織分化結(jié)果Table 2 The differentiated result of calli with different G418 concentration treatment

Cef對(duì)不同繼代次數(shù)愈傷組織平均生長(zhǎng)量的影響，在2個(gè)基因型間存在差異.對(duì)照在第1次繼代后愈傷組織平均生長(zhǎng)量均高于第2次繼代后愈傷組織生長(zhǎng)量.培養(yǎng)中添加不同質(zhì)量濃度的Cef后，基因型87－1×齊319愈傷組織平均生長(zhǎng)量，在不同繼代次數(shù)間均無(wú)顯著差異;而在Cef質(zhì)量濃度為300～600 mg·L－1時(shí)，基因型昌7－2×HiIIA 第1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織平均生長(zhǎng)量，高于第2次繼代培養(yǎng)的愈傷組織平均生長(zhǎng)量，并且，在此情況下二者之間的差值明顯大于在對(duì)照情況下的差值.所以，從2個(gè)基因型不同質(zhì)量濃度間愈傷組織平均生長(zhǎng)量的差異顯著性可以看出，基因型昌7－2×HiIIA的愈傷組織對(duì)Cef的敏感性高于87－1×齊319.

以上分析說(shuō)明，在低質(zhì)量濃度時(shí)，Cef對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，隨著質(zhì)量濃度的增加Cef對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)開(kāi)始具有抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度大于500 mg·L－1時(shí)，Cef對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用顯著加大，隨著繼代次數(shù)的增加，Cef對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用具有一定的累加效應(yīng).但是，不同基因型的愈傷組織對(duì)Cef敏感性具有差異.

表3 Cef對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量影響的差異顯著性分析Table 3 Difference comparison of growth amount with different Cef concentration treatment

Cef對(duì)愈傷組織分化再生能力影響:當(dāng)Cef質(zhì)量濃度為600 mg·L－1時(shí)，基因型87－1×齊319愈傷組織的分化出苗率明顯高于對(duì)照.在培養(yǎng)基中添加Cef后，基因型昌7－2×HiIIA第1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織分化出苗率均高于對(duì)照.而87－1×齊319第1次不同質(zhì)量濃度Cef繼代培養(yǎng)的愈傷組織和昌7－2×HiIIA第2次不同質(zhì)量濃度Cef繼代培養(yǎng)的愈傷組織的分化出苗率與對(duì)照均無(wú)顯著差異.87－1×齊319僅在400 mg·L－1時(shí)，愈傷組織的分化出苗率在不同繼代次數(shù)間呈顯著差異.2個(gè)基因型的愈傷組織經(jīng)不同質(zhì)量濃度Cef處理后，其分化出苗率在2個(gè)基因型間差異不顯著(表4).

表4 Cef對(duì)愈傷組織分化出苗影響的差異顯著性分析Table 4 Difference comparison of regeneration with different Cef concentration treatment

3 結(jié)論與討論

遺傳轉(zhuǎn)化研究中常以抗生素篩選轉(zhuǎn)化材料，尤其在植物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用更為廣泛，但在試驗(yàn)中會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)篩選結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象［5］.所以，在以抗生素作為篩選標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)化中，確定適宜的篩選壓力是提高基因轉(zhuǎn)化率的前提［6］.Kan，G418等是玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究中常用的抗性篩選劑，研究其對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及分化出苗的影響，對(duì)于有效篩選轉(zhuǎn)化體和提高轉(zhuǎn)化效率具有重要意義.

本研究結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度的Kan對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)影響不大，但隨著Kan質(zhì)量濃度的提高及繼代次數(shù)的增加，逐漸開(kāi)始對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，愈傷組織的平均生長(zhǎng)量逐漸減小，但沒(méi)有明顯致死作用，這與前人研究的結(jié)果相似［7，8］.而 Kan對(duì)愈傷組織的分化影響很大，較低質(zhì)量濃度已嚴(yán)重影響了出苗率，6 mg·L－1已經(jīng)很少有綠苗出現(xiàn)，完全白化苗數(shù)量增多.根據(jù)Kan對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和分化再生能力的影響，初步確定用Kan進(jìn)行處理時(shí)，6 mg·L－1的Kan質(zhì)量濃度是玉米愈傷組織的敏感濃度.

通常是以愈傷組織塊的褐化現(xiàn)象作為愈傷組織死亡的標(biāo)準(zhǔn)，但在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中 ，許多轉(zhuǎn)化體是由褐化的愈傷組織塊再生而來(lái)的.僅憑愈傷組織的顏色變化來(lái)定性其為死亡，有欠妥當(dāng)，而在愈傷組織的分化和生根上，則比較易于判斷［9］.抗生素篩選的最終目的是得到轉(zhuǎn)基因苗，所以結(jié)合抗生素對(duì)出苗狀況的影響確定合適的質(zhì)量濃度更為合理.一定質(zhì)量濃度的G418對(duì)玉米愈傷組織的生長(zhǎng)和分化影響都極為明顯.G418能導(dǎo)致愈傷組織很快褐化，出苗率下降.經(jīng)G418處理的愈傷組織在分化過(guò)程中繼續(xù)起作用，愈傷組織進(jìn)一步褐化，說(shuō)明G418對(duì)愈傷組織的毒害作用具有一定的滯后效應(yīng).綜合試驗(yàn)結(jié)果，初步認(rèn)為15 mg·L－1是愈傷組織對(duì)G418的敏感質(zhì)量濃度.由于不同基因型的愈傷組織對(duì)G418的反應(yīng)存在差異，所以在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)對(duì)所用的材料進(jìn)行敏感性測(cè)定，以確定適宜的篩選質(zhì)量濃度.

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)玉米愈傷組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)，需要在培養(yǎng)基中加入抑菌劑及時(shí)有效地殺死或抑制農(nóng)桿菌，同時(shí)不能對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)與分化產(chǎn)生太大的影響，因此，如何選擇抑菌劑及其使用劑量是轉(zhuǎn)化成功的一個(gè)重要因素.氨芐青霉素(Amp)、羧芐青霉素(Carb)和頭孢霉素(Cef)是根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛使用的殺菌劑，它們能以較低的副作用來(lái)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成［10］.這3種抗生素對(duì)大多數(shù)菌株具有較好的殺菌效果，許多學(xué)者認(rèn)為Cef抑菌效果好，負(fù)作用也較小.Cef對(duì)農(nóng)桿菌 LBA4404有較好的抑制作用［11］，Cef質(zhì)量濃度為 200 mg·L－1時(shí)，對(duì)薰衣草的愈傷組織誘導(dǎo)幾乎沒(méi)有影響，同時(shí)又具有很好的抑菌效果［12］.Cef質(zhì)量濃度達(dá)到 500 mg·L－1時(shí)對(duì)棉花切段啟動(dòng)和愈傷組織生長(zhǎng)有影響［13，14］.由于不同材料對(duì)抗菌素的反應(yīng)存在差異，所以轉(zhuǎn)化前確定抗菌素的使用量，將有利于玉米遺傳轉(zhuǎn)化工作的進(jìn)展.本研究表明，Cef對(duì)玉米愈傷組織分化再生能力具有一定的促進(jìn)作用，尤其當(dāng)質(zhì)量濃度大于500 mg·L－1時(shí)，其促進(jìn)作用更為明顯.其他研究者也得出了相似的結(jié)果［15，16］.這可能是由在培養(yǎng)基中加入Cef后，起到了一定的干燥作用，因?yàn)樵谠囼?yàn)過(guò)程中觀察到，含有不同質(zhì)量濃度Cef培養(yǎng)的愈傷組織水份含量明顯低于對(duì)照，并且Cef質(zhì)量濃度越大，干燥程度就越高.有研究表明，玉米愈傷組織經(jīng)過(guò)干燥處理后，可顯著提高其分化出苗率［17］.但是，當(dāng)Cef質(zhì)量濃度大于100 mg·L－1時(shí)，其對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，且隨著Cef質(zhì)量濃度上升，其抑制強(qiáng)度呈增加趨勢(shì).Cef對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的抑制作用在2個(gè)基因型間存在差異.所以，作者認(rèn)為在玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究中，應(yīng)根據(jù)所用材料及農(nóng)桿菌菌株的種類(lèi)在100～200 mg·L－1范圍內(nèi)篩選適宜的Cef使用質(zhì)量濃度較為恰當(dāng).

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