厲榮玉，錢森和，董 群，劉 輝

(1.皖南醫(yī)學院 醫(yī)學微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002;2.安徽工程大學 生物技術教研室，安徽 蕪湖241000)

地木耳，學名普通念珠藻(Nostoccommune)，別名地皮菜、地軟、地耳、地踏菜等，屬藍藻門(Cyanophyta)，藍藻綱(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostoccales)，念珠藻科(Nostocaceae)，念珠藻屬(Nostoc)中的Nostoc communeVauch，為藍藻科念珠藻屬的片狀藻類和真菌的復合體［1］。

研究表明，地木耳富含蛋白質、粗脂肪、粗纖維、礦物質、維生素、氨基酸、藍藻素、多糖等各種營養(yǎng)成分［2－4］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)地木耳細胞提取物中具有生物活性的物質，其提取液對蛋白酶活性、人鼻咽癌細胞、直腸癌細胞的生長和真菌均有抑制作用［5－6］。據(jù)張威［7］(2007)初步研究發(fā)現(xiàn)，地木耳中含有粗多酚及粗黃酮類物質，具有一定的抗氧化和抗腫瘤活性，可以作為一種良好的天然抗氧化劑及抗腫瘤活性物質來源。目前，對地木耳中活性物質研究較多的為水溶性多糖提取，有關地木耳黃酮類化合物生物活性物質的提取研究較少。為此，本文通過單因素和正交試驗對地木耳總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化;并以提取液對常見的幾種微生物進行了抑菌試驗，旨在為地木耳總黃酮在醫(yī)學上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 地木耳采購于蕪湖市神山口菜市場，用蒸餾水洗凈后，晾干保存?zhèn)溆?蘆丁對照品購于中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司，其他試劑均為分析純。試驗所需的主要儀器有TU-1800型紫外-可見分光光度計，RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀，2K-82B型電熱恒溫真空干燥箱，HH-6型電熱恒溫水浴鍋，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺等。

1.2 供試菌種 供試菌種分別為:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、黑曲霉(Aspergillusniger)和白假絲酵母菌(Moniliaalbican)。以上供試菌種均為皖南醫(yī)學院微生物學實驗室保藏菌種。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制［8］精確稱取蘆丁標準品24.3 mg，用30%乙醇溶液溶解后轉移到100 ml容量瓶中定容，配制成0.243 mg/ml的標準溶液。分別吸取標準溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，并用30%乙醇補充至12.5 ml，加入 0.05%NaNO30.56 ml，搖勻后放置 5 min，再加入 0.1%Al(NO3)30.56 ml，搖勻后放置5 min，再加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液?；靹蚝笥?0%乙醇溶液定容。靜置15min后，在500 nm波長下分別測定吸光度(A)，得到標準曲線的回歸方程Y=1.136X+0.0045，R2=0.9967。

1.3.3 地木耳粗黃酮的提取 將地木耳曬干后粉碎，過40目篩得其粉末;取其粉末5 g置于100 ml圓底燒瓶中，在一定的乙醇濃度、料液比、水浴溫度、浸提時間條件下進行浸提，結束后，立刻抽濾并收集濾液;以同樣方法處理濾渣數(shù)次，抽濾并合并濾液，冷卻至室溫后，10 000 r/min離心10 min，除去少量葉綠素及其他水不溶性雜質，上清液定容后作為待測液。檢測后剩余提取液蒸發(fā)濃縮，干燥后得到地木耳總黃酮粗樣品粉末。

1.3.4 黃酮含量的測定 取待測液10 ml于25 ml容量瓶中，加入30% 乙醇溶液2.5 ml使其體積為12.5 ml。之后按1.3.2蘆丁標準曲線的繪制方法操作，測定其在500 nm處的吸光度，并按下式計算總黃酮得率。

1.3.5 總黃酮提取的單因素和正交試驗 試驗提取次數(shù)選取為1次、2次、3次和4次四個水平;乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%六個水平;料液比選取 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和 1∶30 五個水平，提取溫度選取40℃、50℃、60℃、70℃和80℃五個水平;提取時間選取 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h六個水平;分別進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，選取適宜的浸提次數(shù)后，采用適宜的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間進行正交試驗。

1.3.6 地木耳總黃酮的抑菌試驗 將各種待試菌用適宜斜面活化后，以無菌生理鹽水配制成107CFU/ml的菌懸液，備用。量取由驗證試驗得到的總黃酮提取液10 ml作為原液，采用二倍稀釋法，用無菌水配制成不同濃度的溶液，依次為100%、50%、25%、12.5%、6.25%，并以無菌水作為對照，即濃度為0%;經(jīng)微孔過濾器過濾除菌后，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎脼V紙片法進行抑菌試驗，其具體方法是:將已冷卻至45℃的高壓滅菌后的培養(yǎng)基倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌吸管吸取菌懸液0.2 ml涂平板。用無菌鑷子將滅菌后的濾紙片(直徑為6 mm)放入地木耳總黃酮溶液中，浸泡0.5 h后取出，將含樣品的紙片貼于平板上，每個紙片相隔一定間距，每種菌各設3個重復，結果取平均值。將貼好濾紙片的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌于37℃培養(yǎng)24 h，白假絲酵母菌和霉菌于28℃分別培養(yǎng)48 h。使用游標卡尺精確測定濾紙片的抑菌圈直徑大小，比較抑其菌效果。

2 結果與分析

2.1 提取次數(shù)對地木耳總黃酮得率的影響 圖1為乙醇濃度為60%，料液比為1∶15，提取溫度為60℃，提取時間為1.5 h的條件下，提取次數(shù)對地木耳總黃酮得率的影響。由圖可知，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮得率逐漸增加，當提取次數(shù)大于2次時，總黃酮提取得率增加幅度明顯減小。因此，從生產(chǎn)成本及效率方面考慮，選擇浸提次數(shù)為2次較為合適。

圖1 浸提次數(shù)對地木耳總黃酮得率的影響Fig1 The effect of extraction frequencies on the yield of total flavonoids from Nostoc commune

2.2 乙醇濃度對地木耳總黃酮得率的影響 圖2為提取次數(shù)為2次，料液比為1∶15，溫度為60℃時，提取時間為1.5 h，不同乙醇濃度對總黃酮得率的影響?？梢钥闯?，隨著乙醇體積的增多，黃酮得率逐漸增加，當乙醇濃度為80%時，其得率為最大值;濃度超過80%時，黃酮得率反而下降，其可能原因是提取溶劑中乙醇含量增大，從而造成脂溶性雜質增多的緣故［9］。另外，當乙醇濃度為70%時，黃酮得率為6.09%，與最大值6.14%相差無幾。因此，從生產(chǎn)工藝對試劑損耗方面考慮，選擇乙醇濃度為70%較為經(jīng)濟。

圖2 乙醇濃度對地木耳總黃酮含量的影響Fig2 The effect of ethanol concentration on harvesting total flavonoids from Nostoc commune

2.3 料液比對地木耳總黃酮得率的影響 圖3為提取次數(shù)為2次，乙醇濃度為70%，提取溫度為60℃時，提取時間為1.5 h，不同料液比對地木耳總黃酮得率的影響。結果表明，隨著料液比的增加，總黃酮的得率顯著增加;當料液比大于1∶20時，其得率反而有下降的趨勢。可能原因是隨著溶劑的增加，總黃酮的溶解量也增加，當總黃酮已全部溶解，即使再增加溶劑的量，也不會使溶劑中的總黃酮的量增加，反而會稀釋了總黃酮的溶質濃度，從而不利于總黃酮的沉淀。另外，考慮到料液比較大時，干燥、濃縮的工作量及能耗都相應增大，不符合實際生產(chǎn)的成本要求，因此，料液比不宜過高。

圖3 料液比對地木耳總黃酮得率的影響Fig3 The effect of material/solvent ratio on output of total flavonoids from Nostoc commune

2.4 溫度對地木耳總黃酮得率的影響 圖4為提取次數(shù)為2次，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，時間為1.5 h時，不同提取溫度對地木耳總黃酮得率的影響。從中可以看出，當提取溫度從40℃增加到70℃時，地木耳總黃酮的得率增加較為明顯，當溫度大于70℃時，其得率增加幅度明顯減小?？赡茉蚴菧囟冗^高會對黃酮類化合物的結構造成破壞，同時加速了乙醇的揮發(fā)，從而影響到總黃酮的得率。因此，黃酮的提取溫度不宜過高。

圖4 提取溫度對地木耳總黃酮得率的影響Fig4 The effect of extraction temperature on Nostoc commune flavonoids products

2.5 時間對地木耳總黃酮得率的影響 總黃酮浸出與時間的關系較為密切，時間過短，總黃酮不能完全浸出，時間過長，更多的雜質被溶解，從而影響其得率［10］。圖 5為提取次數(shù)為 2次，乙醇濃度為70%，料液比為1∶20，提取溫度為70℃時，不同提取時間對地木耳總黃酮得率的影響。結果表明，當提取時間小于2 h時，地木耳總黃酮得率增加顯著;當提取時間大于2 h時，其總黃酮得率增加緩慢，幾乎維持在同一水平。考慮到浸提時間延長能耗增加等因素，選取浸提時間為2 h。

圖5 提取時間對地木耳總黃酮得率的影響Fig5 The effect of extraction duration on the output of total flavonoids form Nostoc commune

2.6 正交法提取地木耳總黃酮 為了考慮到各因素之間的相互作用，在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗。以提取次數(shù)為2次，采用L16(45)正交表，對乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和進行四因素三水平正交試驗。正交試驗設計及其結果如表1所示，其方差分析如表2所示。

表1 正交試驗結果與分析Tab1 Orthogonal test results and analysis

由表1正交試驗極差分析結果可知，各因素對總黃酮得率影響大小的順序為:乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間。通過表2正交試驗方差分析結果可知，乙醇濃度、液料比和提取溫度對地木耳總黃酮得率的影響達到了極顯著水平，提取時間對地木耳總黃酮得率的影響差異不顯著，但黃酮得率也有一定的影響。

表2 正交試驗結果的方差分析Tab2 Analysis of variances for total flavonoids yield

由表1極差分析T值可知，當提取次數(shù)為2次時，地木耳總黃酮提取的最優(yōu)水平組合為乙醇濃度70%、料液比為1∶20、提取溫度80℃，提取時間為2.5 h。在此條件下，進行地木耳總黃酮提取驗證試驗，3次重復，其總黃酮平均得率為6.84 mg/g。

2.7 地木耳總黃酮對常見微生物的抑菌活性 由驗證試驗所得黃酮得率為6.84 mg/g，地木耳黃酮提取液濃度為 100%、50%、25%、12.5%、6.25和0%所對應的實際黃酮含量分別為0.342 mg/ml、0.171 mg/ml、0.0855 mg/ml、0.04275 mg/ml、0.02138 mg/ml和 0 mg/ml。選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白假絲酵母菌四種日常生活中常見的細菌、霉菌和酵母菌作為試驗材料，測試所提取的總黃酮對這些菌種的抑菌效果，其結果見圖6。

圖6 地木耳總黃酮的抑菌作用Fig6 The antimicrobial activities of Nostoc commune flavonoids on certain microorganisms

圖6結果表明，地木耳總黃酮對四種微生物均有不同程度的抑制作用，隨著總黃酮溶液質量濃度的升高，抑菌圈直徑有遞增趨勢性。其中，地木耳總黃酮對典型的革蘭陽性細菌金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對革蘭陰性細菌抑制作用相對較弱;對酵母菌抑菌活性相對較強，而對產(chǎn)孢子的霉菌抑制能力較弱?？梢?，地木耳黃酮具有一定的廣譜抑菌活性。

3 討論

黃酮類化合物是廣泛存在于植物體內(nèi)，能夠清除人體內(nèi)自由基，具有抗老化、抗突變、調(diào)血脂、降血壓、抑菌等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑［11－12］。本研究通過單因素試驗和正交試驗得出了地木耳總黃酮提取的最佳條件，即提取溫度為乙醇濃度70%、料液比為1∶20、提取溫度80℃，提取時間為2.5 h，提取次數(shù)為2次，在此最佳條件下總黃酮得率為6.84 mg/g，這為地木耳黃酮的應用提供了的前提條件。

另外，試驗結果表明，地木耳總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白假絲酵母均有一定的抑制作用，其抑菌效果為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白假絲酵母＞黑曲霉。黃酮類化合物可以通過破壞細胞壁及細胞膜的完整性，導致微生物細胞釋放胞內(nèi)成分，引起膜的電子傳遞、營養(yǎng)吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障礙，從而抑制微生物的生長［13］。由于真菌的細胞壁厚于細菌的細胞壁，導致黃酮類化合物對兩種類型菌的細胞壁和細胞膜損傷程度不同所造成的。從而造成地木耳總黃酮對細菌抑制作用大于真菌。革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的細胞壁組成成分不同，革蘭陽性菌肽聚糖層多，革蘭陰性菌肽聚糖層數(shù)少，黃酮類化合物有可能影響肽聚糖的交聯(lián)，進而破壞細胞壁形成。也有研究表明［14］，抑菌性的差異可能與樣品作用于細胞壁和細胞膜系統(tǒng)，或者對酶的抑制、代謝過程的破壞有著密切關系，但具體原因還有待于進一步研究。本文通過地木耳總黃酮的抑菌試驗，初步得出了一定的結論，但由于試驗選用菌種有限，其試驗結果還不夠全面，在今后的研究中將利用地木耳總黃酮對大量的微生物進行系統(tǒng)的抑菌試驗，并深入探討其抑菌效果和機制，為新型天然抗菌劑的開發(fā)提供依據(jù)。

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