李智峰，李高強(qiáng)，田云霄，袁艷龍，司華鵬，梁冰鋒

（1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院普外一科，河北邯鄲 056002；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北邯鄲 056001；3.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河北石家莊 050091）

VEGF-C、VEGF-D及其受體Flt-4在胰腺癌中的表達(dá)及意義

李智峰1，李高強(qiáng)1，田云霄2，袁艷龍2，司華鵬1，梁冰鋒3

（1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院普外一科，河北邯鄲 056002；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北邯鄲 056001；3.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河北石家莊 050091）

目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-C、VEGF-D及fms-like tyrosine kinase-4（Flt-4）蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)及與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法選擇根治性手術(shù)切除的胰腺癌組織63例及正常胰腺組織13例。采用免疫組織化學(xué)法（Envision法）檢測(cè)胰腺癌組織及正常胰腺組織中VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)，檢測(cè)癌周組織及正常胰腺組織中Flt-4的表達(dá)，并結(jié)合患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果63例胰腺癌組織中VEGF-C陽性表達(dá)38例（60.3%）、VEGF-D陽性表達(dá)40例（63.5%）、癌周Flt-4陽性表達(dá)41例（76.2%），均高于正常胰腺組織（P＜0.05）。VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的高表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存率密切相關(guān)（P＜0.05）。胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D與癌周Flt-4蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論VEGF-C、VEGF-D在胰腺癌中表達(dá)增高，F(xiàn)lt-4在癌周組織中表達(dá)增高，表明它們與胰腺癌的生物學(xué)侵襲性行為有關(guān)。在胰腺癌中VEGF-C、VEGF-D均與Flt-4的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存期密切相關(guān)，表明VEGF-C、VEGF-D和Flt-4可以促使胰腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且在轉(zhuǎn)移過程中有相互促進(jìn)作用。

胰腺腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；免疫組織化學(xué)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，5年生存率僅3%左右，早期即有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，研究胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制具有極其重要的臨床意義。研究［1-2］表明，腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移與其血管及淋巴管新生有著密切聯(lián)系，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最關(guān)鍵的促血管和淋巴管生成因子，F(xiàn)lt-4（fms-like tyrosine kinase-4）作為VEGF的受體主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮。VEGF-C、D可選擇性地作用于Flt-4受體促進(jìn)血管淋巴管的增生，在腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移中有著至關(guān)重要的作用。已有報(bào)道［3］證實(shí)VEGF及其受體在前列腺癌、胃癌、食管癌、大腸癌、乳腺癌等多種原發(fā)性腫瘤中存在異常表達(dá)，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明確相關(guān)。但其在胰腺癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系報(bào)道尚少。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2005年1月—2009年1月河北省邯鄲市第一醫(yī)院及邯鄲市中心醫(yī)院肝膽外科行胰十二指腸切除并均經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌病例63例，其中男性43例，女性20例，年齡37～79歲，平均59.7歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，占39.7%；所有患者術(shù)前均未行任何抗癌治療。術(shù)后失訪4例，隨訪結(jié)束時(shí)仍存活9例，生存時(shí)間1～45個(gè)月，中位生存期11個(gè)月。癌周組織為距腫瘤邊緣0.3～0.5cm，無癌細(xì)胞浸潤(rùn)。正常胰腺標(biāo)本共13例，來自邯鄲市第一醫(yī)院病理科非胰腺疾病死亡者尸檢存檔蠟塊，病理學(xué)檢查證實(shí)全部為正常胰腺組織。

1.2 方法：采用免疫組織化學(xué)Envision法進(jìn)行染色觀察，兔抗人VEGF-C、VEGF-D及Flt-4單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Envision二抗等購(gòu)自上海長(zhǎng)島公司。用已知的乳腺癌陽性切片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定，VEGF-C、VEGF-D主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿，F(xiàn)lt-4主要表達(dá)于癌周毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，以細(xì)胞內(nèi)含有棕黃或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。每例切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)/400倍視野，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按Shimizu方法，≥3分為陽性。所有鏡檢及計(jì)數(shù)均由兩位不了解患者臨床病理特征的病理專家完成。

1.3 隨訪：觀察至2012年1月，隨訪時(shí)間自手術(shù)之日開始，以死亡時(shí)間或隨訪結(jié)束截止，總生存時(shí)間為從手術(shù)之日到死亡時(shí)間或隨訪結(jié)束截止。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以隨訪結(jié)束為截止分析生存情況，采用Kaplan-Meier單因素生存分析計(jì)算患者生存率，生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌組織中VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的蛋白表達(dá)：VEGF-C在13例正常胰腺組織中陽性表達(dá)3例（23.1%），在63例胰腺癌組織中的陽性（圖1）表達(dá)38例（60.3%），胰腺癌組織陽性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織（P＜0.05）。VEGF-D在13例正常胰腺組織中陽性表達(dá)3例（23.1%），在63例胰腺癌組織中的陽性（圖2）表達(dá)40例（63.5%），胰腺癌組織陽性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織（P＜0.05）。Flt-4主要表達(dá)于癌周淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（圖3），在13例正常胰腺組織中陽性表達(dá)4例（30.8%），在63例胰腺癌周圍組織中的陽性表達(dá)41例（65.1%），胰腺癌組織陽性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織（P＜0.05）。見表1。

2.2 VEGF-C、VEGF-D及Flt-4蛋白陽性表達(dá)與生存期的關(guān)系：63例患者中位生存期為11個(gè)月。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的中位生存期5個(gè)月和14個(gè)月；VEGF-C陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存7個(gè)月和16個(gè)月；VEGF-D陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存8個(gè)月和16個(gè)月；Flt-4蛋白陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存7個(gè)月和15個(gè)月。Kaplan-Meier單因素生存分析計(jì)算生存率，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的生存率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的生存率（P＜0.01）；VEGF-C、VEGF-D和Flt-4陰性患者生存率均高于VEGF-C、VEGF-D和Flt-4陽性的患者（P＜0.05），見表2。

表1 VEGF-C、VEGF-D和Flt-4在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)Table 1 Exp ression of VEGF-C，VEGF-D andFlt-4 protein in pancreatic carcinoma，and norm al pancreatic tissue

2.3 胰腺癌組織中VEGF-C、VEGF-D和Flt-4陽性表達(dá)相關(guān)性及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系：63例胰腺癌組織中VEGF-C、VEGF-D的高表達(dá)均與Flt-4蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（rs=0.425，0.413，P＜0.01）。VEGF-C與VEGF-D的表達(dá)無相關(guān)性（P＞0.05）。25例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF-C蛋白陽性表達(dá)21例（84%）、VEGF-D蛋白陽性表達(dá)23例（92%）、Flt-4蛋白陽性表達(dá)23例（92%），均顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)（P＜0.01）。見表3～5。

表2 VEGF-C、VEGF-D、Flt-4及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胰腺癌患者生存率的關(guān)系Table 2 The expression of VEGF-C，VEGF-D，F(xiàn)lt-4 and lymph nodemetastasis in relation to themedian survival time of 63 patientsw ith pancreatic carcinoma

表3 Flt-4與VEGF-C及VEGF-D表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation between Flt-4 and VEGF-C or VEGF-D protein expression in 63 cases of pancreatic carcinom a

表4 VEGF-C與VEGF-D表達(dá)的相關(guān)性Table 4 Correlation between VEGF-C and VEGF-D protein expression in 63 cases of pancreatic carcinoma

表5 VEGF-C、VEGF-D及Flt-4的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 5 Expression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 protein in relation to the lymph nodemetastasis

3 討 論

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近30年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)（增長(zhǎng)了3～7倍），其病死率居惡性腫瘤的第4位［4］。胰腺癌惡性程度高、發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、病死率高、預(yù)后差，5年生存率小于3%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差的主要原因之一。近年來，VEGF家族因有促進(jìn)血管淋巴管增生導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用而備受關(guān)注。

VEGF家族由不同的剪接可產(chǎn)生VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長(zhǎng)因子等5種不同的表現(xiàn)形式。VEGF-C和VEGF-D均具有特異性促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用，被認(rèn)為與腫瘤的淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［5］。VEGF-C、VEGF-D已經(jīng)在多種不同的惡性腫瘤中被證實(shí)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，如乳腺癌、胃癌［6-7］、胰腺癌等。Kurahara等［8］利用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)58例手術(shù)切除的胰頭導(dǎo)管腺癌標(biāo)本VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)率及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后等之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，癌組織中VEGF-C和D陽性表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于陰性表達(dá)組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的5年生存率明顯低于陰性組，提示胰頭癌組織中VEGF-C和D的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

腫瘤周圍組織被認(rèn)為是瘤細(xì)胞擴(kuò)散入淋巴管的最關(guān)鍵部位，其內(nèi)高密度的血管淋巴管是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)［9］。我們?cè)趯?duì)Flt-4研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其主要陽性表達(dá)于癌周的毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，少量表達(dá)于毛細(xì)血管及胰島細(xì)胞中。VEGF-C、VEGF-D表達(dá)升高可作用于受體Flt-4，使其表達(dá)升高，而促使淋巴管新生，且由于Flt-4調(diào)節(jié)生成的淋巴管缺乏完整的基膜，內(nèi)皮細(xì)胞間的縫隙大，通透性較高［10］，再加上內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用［11］，加速了腫瘤細(xì)胞與淋巴管的接觸的幾率，造成轉(zhuǎn)移。

本研究胰腺癌63例中VEGF-C陽性表達(dá)38例（60.3%），VEGF-D陽性表達(dá)40例（63.5%），F(xiàn)lt-4在胰腺癌周組織中的陽性表達(dá)41例（65.1%），均明顯高于正常胰腺組織（P＜0.05），結(jié)果提示VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的高表達(dá)參與了胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。隨訪發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的中位生存5個(gè)月和14個(gè)月；VEGF-C陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存7個(gè)月和16個(gè)月；VEGF-D陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存8個(gè)月和16個(gè)月；Flt-4蛋白陽性和陰性表達(dá)的患者的中位生存7個(gè)月和15個(gè)月。生存曲線分析顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的生存率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的生存率，VEGF-C、VEGF-D和Flt-4陽性性患者生存率均明顯低于VEGF-C、VEGFD和Flt-4陰性患者，VEGF-C、VEGF-D和Flt-4均與胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示陽性患者與陰性患者之間的生存期存在差異，它們是獨(dú)立性預(yù)測(cè)指標(biāo)還是其預(yù)測(cè)性是通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間接顯示，尚有待于大樣本多因素分析得出，但我們的研究結(jié)果強(qiáng)烈提示VEGFC、VEGF-D及Flt-4蛋白陽性表達(dá)可作為判斷影響胰腺癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)［12］。此外，VEGF-C、VEGF-D的高表達(dá)均與Flt-4蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

綜上所述，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為胰腺癌患者獨(dú)立預(yù)后的因素，而VEGF-C、VEGF-D和Flt-4在胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起到相互促進(jìn)作用，從而影響胰腺癌患者的預(yù)后。因此，在臨床上，檢測(cè)VEGF-C、VEGF-D和Flt-4的表達(dá)率升高均可作為胰腺癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因素。通過選擇性阻斷其通路可為胰腺癌的治療帶來希望［12-13］。

［1］ DALLAGOCH，OLIVEIRA MC，BARBOSA-COUTINHO LM，et al.Angio genesis in craniopharyngiomas：mier ovascular denisty and tissue expression of the vascular endothelial growth factor（VEGF）and endostatin［J］.Endocr Pathol，2005，16（4）：355-362.

［2］ AVETISON SE，MAMIKOIAN VR，SURGUCH BK，et al. Antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization induced by age-related emacular dugeneration C preliminarv communication［J］.Vestn Oftalmol，2009，125（6）：3-8.

［3］ 李良，董勤，王茂春.VEGF與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2010，42（9）：1072-1075.

［4］ MULDER I，HOOGENVEEN RT，VAN GENUGTEN M，et al. Smoking cessation would suhstantially reduce the future incidence of pancreatic cancer in the European Union［J］.Gastroenterol Hepatol，2002，14（12）：1343-1353.

［5］ MAEDA S，SHINCHI H，KURAHARA H，et al.CD133 expression is correlated with lymph nodemetastasis and vascular endothelial growth factor-C expression in pancreatic cancer［J］. Br JCancer，2008，98（8）：1389-1397.

［6］ JUNGHC，YOUNG HO，YONGWP，etal.Correlation of vascular endothelial growth factor-D expression and VEGFR-3-positive vessel density with lymph node metastasis in gastric carcinoma［J］.JKorean Med Sci，2008，23（4）：592-597.

［7］ ARIGAMI T，NATSUGOE S，UENOSONO Y，et al.Vascular endothelial growth factor-C and-D expression correlates with lymph node micrometastasis in pN0 early gastric cancer［J］.J Surg Oncol，2009，99（3）：148-53.

［8］ KURAHARA H，TAKAO S，MAEMURA K，et al.Impact of vascular endothelial growth factor-C and-D expression in human pancreatic cancer：its relationship to lymph node metastasis［J］.Clin Cancer Res，2004，10（24）：8413-8420.

［9］ 陳元文，錢學(xué)華.VEGF-C表達(dá)和淋巴管生成與胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，30（4）：540-543.

［10］ MARSCHALL Z，SCHOLZ A，STACKER SA，et al.Vascular endothelial growth factor-D induces lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in models of ductal pancreatic cancer［J］. Int JOncol，2005，27（3）：669-679.

［11］ LUCIE K，TANJA V，VALENTIN G，et al.Distinct roles of vascular endothelial growth factor-d in lymphangiogenesis and metastasis［J］.Am JPathol，2007，170（4）：1348-1361.

［12］ DANIEL BC，ERIC HJ，ASHOK KS，et al.Molecular targeted thrapies for pancreatic cancer［J］.Am J Surg，2008，196（3）：430-441.

［13］ LIU X，ZHANG M，GO VL.Membrane proteomic analysis of pancreatic cancer cells［J］.JBiomed Sci，2010，17（1）：74.

（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF VEGF-C，VEGF-D AND IT′SRECEPTOR Flt-4 IN HUMAN PANCREATIC CARCINOMA

LIZhifeng1，LIGaoqiang1，TIAN Yunxiao2，YUAN Yanlong2，SIHuapeng1，LIANG Bingfeng3
（1.Department of Surgery，the Frist Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China；2.Department of Pathology，The Central Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；3.Department of Nursing，HebeiWomen′s Vocational College，Shijiazhuang 050091，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）-C，VEGF-D and fms-like tyrosine kinase-4（Flt-4）in pancreatic cancer，and analyze the relationships between the expression and the clinicopathological characteristics of pancreatic carcinoma.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4.Statistical analysis was used to determine the relationship between the expression and clinicopathological parameters of pancreatic Carcinoma.ResultsThe positive rates of VEGF-C and VEGF-D in pancreatic carcinoma were 60.3%（38/63）and 63.5%（40/63），which were significantly higher than the positive rates 23.1%（3/13）and 23.1%（3/13）in normal pancreatic tissue respectively（P＜0.05）.The positive rates of Flt-4 in paraneoplastic and normal pancreatic tissue were 76.2%（41/63）and 30.8%（4/13）respectively（P＜0.05）.The expressions of VEGF-C and VEGF-D in pancreatic carcinoma were correlated positively with the expressions of Flt-4 in paraneoplastic tissue（P＜0.05）.The overexpression of VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 in pancreatic cancerwere correlated significantly with lymph node metastasis and survival time of patients（P＜0.05）.ConclusionThe expression of VEGF-Cand VEGF-D in pancreatic cancer increases，so does the expression of Flt-4 in cancer tissues，which indicate that they are related to the biology invasive behavior of pancreatic cancer. In pancreatic cancer，both the expression of VEGF-C and VEGF-D are positively correlated with the expression of Flt-4 significantly，furthermore，they are closely linked with lymph node metastasis and patient survival，indicating that VEGF-C，VEGF-D and Flt-4 can provide pancreatic cancer with lymph node metastasis，and havemutual promotion in the process ofmetastasis.

pancreatic neoplasms；vascular endothelial growth factors；immunohistochemistry

R735.9

A

1007-3205（2012）08-0890-04

2012-01-17；

2012-04-07

河北省科技廳科學(xué)技術(shù)支撐項(xiàng)目（09276153）

李智峰（1976-），男，河北魏縣人，河北省邯鄲市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝膽外科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.08.009