武其文,范含萍,江 峰,浦 春
(皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心1.檢驗科;2.婦產(chǎn)科;3.超聲醫(yī)學科,安徽 蕪湖 241001)
染色體疾病是一種常見的遺傳病,無論是染色體數(shù)目異常還是結構異常均可導致先天畸形、智力低下、流產(chǎn)、不孕、生長發(fā)育障礙等,是造成新生兒出生缺陷常見的原因[1]。應用胎兒脫落羊水細胞培養(yǎng)進行染色體核型分析是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的主要方法之一,但羊水細胞培養(yǎng)技術要求高、難度大、成功率不穩(wěn)定。如何取得較高的羊水細胞培養(yǎng)成功率,是這項技術成功應用于臨床的關鍵。我院產(chǎn)前診斷中心遺傳室自2009年開展此項技術,針對羊水細胞培養(yǎng)技術進行了努力的探索和改良,經(jīng)歷了一段時間后取得了滿意的效果,現(xiàn)報道如下。
1.1 研究對象 收集2009年10月~2011年10月期間,因有產(chǎn)前診斷指征在我院接受羊水細胞培養(yǎng)產(chǎn)前診斷的孕婦共238例,年齡22~45歲,孕周16~30周(其中>22周7例)。孕婦簽署知情同意后實施羊膜腔穿刺術。孕婦產(chǎn)前診斷的指征包括:①孕婦年齡≥35歲;②孕婦曾經(jīng)生育過染色體異?;純菏?③母血清生化篩查高風險;④超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常;⑤夫婦一方有染色體結構異常者;⑥孕婦有原因不明的多次流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史;⑦羊水過多或過少。
1.2 方法
1.2.1 羊膜腔穿刺采集標本 穿刺前囑孕婦側臥輕輕上下?lián)u動腹部數(shù)次,常規(guī)下腹部皮膚消毒、鋪巾,在B超引導下用一次性羊水穿刺針(21 G)經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術并抽取羊水。先用5 ml注射器抽取羊水2~3 ml棄去,再用20 ml注射器抽取羊水20 ml,立即送細胞培養(yǎng)室。
1.2.2 細胞培養(yǎng) 將20 ml羊水分裝于兩只15 ml無菌離心管(Falcon產(chǎn)品)中,1 000 r/min離心8 min,棄上清,保留每管1 ml,以滴管打勻,分別接種2個瓶口帶濾膜的50 ml培養(yǎng)瓶(Falcon產(chǎn)品)的底部,擰緊瓶蓋放置超凈工作臺中靜止10 min,再沿培養(yǎng)瓶邊緣緩緩加入AminoMAX羊水完全培養(yǎng)基(GIBCO產(chǎn)品)4 ml,使其覆蓋細胞懸液,置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 d后更換培養(yǎng)液并在倒置顯微鏡下每日觀察細胞生長情況,直至收獲。
1.2.3 細胞收獲及制片 當顯微鏡下見貼壁生長的羊水細胞形成較大的克隆,并出現(xiàn)成對的圓形透亮細胞時,即可進行細胞收獲。收獲前加入20μg/ml的秋水仙素(湖南湘雅基因技術有限公司產(chǎn)品)3滴,使終濃度達到0.2μg/ml,作用2 h后,倒去培養(yǎng)瓶上清,加入0.25%胰蛋白酶(Sigma產(chǎn)品)2 ml,37℃水浴箱消化5 min,用細胞刮刀將貼壁細胞刮下,再用吸管反復吹打數(shù)次,將細胞懸液移入離心管,進行離心、低滲、固定等步驟,按本室常規(guī)方法染色體制片。
1.2.4 染色體G顯帶及核型分析 制備好的玻片,置75℃烤箱中烤片3 h,0.05%胰酶消化,Giemsa染色顯帶。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 1995)標準進行核型分析診斷。常規(guī)計數(shù)20個分裂相,分析5個分散良好的核型,異常核型加倍計數(shù)40個分裂相。
2.1 細胞培養(yǎng)結果 238例孕婦的羊水細胞培養(yǎng),一次羊膜腔穿刺即培養(yǎng)成功227例,成功率為95.4%。11例初次培養(yǎng)失敗孕婦有4例進行了二次羊穿,全部培養(yǎng)成功,總成功率為97.1%。剩余7例培養(yǎng)失敗中分析其原因,有1例為胎糞污染、4例細胞貼壁生長不良、2例孕周偏大(>25周)。羊水細胞培養(yǎng)的時間最短6 d收獲,最長10 d收獲,大部分羊水細胞在培養(yǎng)第7天,可見較多的克隆貼壁旺盛的生長,是收獲的最佳時機,見圖1。
圖1 羊水細胞培養(yǎng)第7天(10×20)Fig1 Amniotic fluid cells cultured for 7 days
2.2 染色體核型分析結果 在成功培養(yǎng)的231例羊水中共發(fā)現(xiàn)8例染色體異常,異常率占3.5%。其中發(fā)現(xiàn)21三體2例、18三體1例、Turner綜合征2例、Klinefelter綜合征1例、結構異常1例,嵌合體1例;另外,發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性4例,分別為Yqh+2例,9qh+1例,16qh+1例。其余染色體核型均為正常。8例異常染色體結果及胎兒結局見表1。
表1 8例異常染色體核型分析結果及胎兒結局Tab1 8 cases of abnormal karyotype results and fetal outcomes
2.3 典型的染色體核型分析圖 見圖2、3。
圖2 18三體染色體核型圖(箭頭所示為18號染色體,10×100)Fig2 Trisomy of18 karyotype map(the arrow shows the chromosome 18,10 ×100)
圖3 21三體染色體核型圖(箭頭所示為21號染色體,10×100)Fig3 Trisomy of 21 karyotype map(the arrow shows the chromosome 21,10 ×100)
自1966年Steele首次報道羊水細胞培養(yǎng)成功并應用于臨床胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷以來,至今此項技術仍是產(chǎn)前診斷染色體病最安全、經(jīng)濟和有效的方法[2]。但羊水細胞培養(yǎng)是一項技術要求高、難度大、培養(yǎng)時間長、分裂相較少、成功率不穩(wěn)定的實驗項目[3-4]。我們在羊水培養(yǎng)過程中對標本采集、細胞接種、收獲制片等環(huán)節(jié)做了一些探討和改良,獲得了較為滿意的結果。238例羊水有231例培養(yǎng)獲得成功,總成功率達97.1%?,F(xiàn)將經(jīng)驗總結如下。
首先,在標本采集方面,羊膜腔穿刺是有創(chuàng)性操作,穿刺前應做好準備工作,穿刺時做到嚴格無菌,一旦被細菌污染,不僅導致培養(yǎng)失敗,而且對孕婦和胎兒也會造成感染和流產(chǎn)的危險[5]。其次,在標本接種方面,我們做了以下的改良,20 ml羊水分成2管離心接種2個培養(yǎng)瓶,離心后留取較多的細胞懸液(1 ml)進行接種。由于羊水細胞在制取過程中容易丟失,我們把羊水細胞懸液直接接種于培養(yǎng)瓶底部,經(jīng)過一段時間(10 min)靜置后再加入培養(yǎng)基培養(yǎng),使細胞提前集中貼壁,減少丟失,結果發(fā)現(xiàn)有效細胞克隆形成更早更多。這種改進不僅提高了培養(yǎng)的成功率,而且延長了羊水采集的孕周。一般認為,羊水標本采集在孕16~22周為宜,此時羊水中含有的活性細胞最多[6-7]。但我們的培養(yǎng)方法在 >22周羊水標本中也有5例獲得了培養(yǎng)成功。最后,收獲時機的把握是制得良好核型的關鍵。羊水細胞平均貼壁時間約為5~7 d,開始貼壁多見胎兒上皮樣細胞及梭長形羊水細胞(AF細胞),形成的細胞克隆覆蓋1個或1個以上的完整視野進行換液,當培養(yǎng)瓶中有較多的細胞克隆,周邊細胞生長旺盛,存在有較多的圓形或雙圓形透亮細胞,為最佳收獲時機。
231例羊水染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)8例異常,異常率占 3.5%,異常率與國內(nèi)有關報道相近[8-9]。發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體6例,包括21三體2例、18三體1例、Turner綜合征2例、Klinefelter綜合征1例。染色體非整倍體是活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率較高的染色體疾病,均會造成新生兒發(fā)生嚴重的出生缺陷。6例非整倍體嬰兒,經(jīng)驗證和孕婦同意后均做了引產(chǎn)手術,有效地避免了非整倍體嬰兒的出生。231例羊水分析還發(fā)現(xiàn)了染色體結構異常1例[46,XY,t(2p,7q)]以及嵌合體 1 例(46,XX/69,XXX)。染色體結構異常的胎兒來源于其父親的平衡易位,并不引起遺傳物質(zhì)量的丟失。由于其父親表型正常,經(jīng)孕婦同意,該嬰兒得以保留,出生后未見表型異常。羊水嵌合體的胎兒的處理需要謹慎[10],本例經(jīng)臍帶血穿刺驗證后為假性嵌合,胎兒出生后也未見異常。另外,我們還發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性4例,分別為Yqh+2例,9qh+1例,16qh+1例,均為人類染色體的異態(tài)性,同樣這些胎兒均予以了保留。通過對已娩出的新生兒電話隨訪,胎兒出生后均表型正常且性別完全吻合。
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