李?lèi)?ài)蘭，吉兆寧

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

肺癌是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是其惡性的標(biāo)志，為患者治療失敗和死亡的主要原因，因?yàn)槿狈τ行У脑缙谠\斷手段及治療轉(zhuǎn)移性肺癌的方法，其五年生存率較低。血行性播散是肺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要方式之一，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)在外周血循環(huán)中，是腫瘤血行播散和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，但由于外周循環(huán)血中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量非常少，常規(guī)臨床檢查難以發(fā)現(xiàn)，如對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法須有較高的靈敏度和特異度，RT-PCR技術(shù)使檢測(cè)外周血中的微量癌細(xì)胞成為可能。目前在肺癌早期轉(zhuǎn)移的研究中缺乏較為公認(rèn)的特異性分子標(biāo)記物［1］。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞現(xiàn)被認(rèn)為是肺癌的祖細(xì)胞，它能夠合成分泌肺表面活性蛋白C(pulmonary surfactant protein C，SP-C)，正常外周血單核細(xì)胞中不表達(dá)SP-C mRNA，其mRNA是由上皮組織和上皮組織來(lái)源的腫瘤組織中的相關(guān)基因的特異性表達(dá)，如在外周血中擴(kuò)增出上皮組織特異性標(biāo)志物的表達(dá)，則可表明有上皮源性的腫瘤細(xì)胞播散到間質(zhì)組織外周血中，發(fā)生了微轉(zhuǎn)移［2］。因此，我們選擇了SP-C作為分子標(biāo)記物，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)44例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血SP-C mRNA，通過(guò)分析與臨床病理特征的關(guān)系，以探討其作為肺癌微轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 44例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者均來(lái)源于弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，病理學(xué)診斷明確，且臨床影像學(xué)檢查未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其臨床病理特征如下:55歲及以上36例，55歲以下8例，男性32例，女性12例，腺癌24例，鱗癌20例。低分化26例，高分化18例，TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期患者30例，Ⅲ期患者14例。另外選擇20例肺部良性疾病患者及10名健康人作為對(duì)照組。

1.2 方法 試劑與引物設(shè)計(jì):參照Genbank，采用Primer Premier5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)SP-C基因內(nèi)外引物，上游序列:5'-TGGTGGTCCTCATCGTCG-3'，下游序列:5'-GGAGAAGGTGGCAGTGGTAA-3'，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度161pb。內(nèi)參引物為GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)，以檢測(cè)RNA的完整性，GAPDH-上游序列:5'-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3'，GAPDH-下 游:5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度306 bp，由上海生工公司合成。

標(biāo)本的收集與RNA抽提:抽取新鮮血5 ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行有核細(xì)胞的分離，Trizol法提取有核細(xì)胞的RNA。

RNA質(zhì)量檢測(cè):對(duì)所抽提的RNA行純度分析，計(jì)算A260/A280比率，其中A260/A280比率應(yīng)為1.6～1.8，并行1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察RNA的完整性。

cDNA第一鏈合成:取 RNA約1μl加入20μl反應(yīng)體系中，按照試劑盒提供的條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

PCR擴(kuò)增:SP-C mRNA與GAPDH(內(nèi)參)按照摸索好的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。具體為:SP-C PCR反應(yīng)體系25 μl，其中cDNA 3 μl，稀釋后的SP-C 引物2 μl，PCR Mix 12.5 μl，再加入滅菌雙蒸去離子水7.5 μl，使總體積達(dá)25μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min一個(gè)循環(huán);94℃變性40 s，58°C退火40 s，72℃延伸60 s，共32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min一個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物分析:SP-C擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，加6×loadingbuffer 1μl混勻上樣于1%瓊脂糖凝膠電泳，90 V恒壓，30 min，EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用STATA 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料分析，相關(guān)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中所抽提的RNA A260/A280比率值在1.72～1.95之間，外周血抽提總RNA約1 000～1 500 ng，1%瓊脂糖電泳，EB染色可見(jiàn)28 s、18 s亮帶。

2.2 肺癌患者和對(duì)照組SP-C mRNA的表達(dá) 44例肺癌患者外周血中SP-C mRNA陽(yáng)性26例，表達(dá)陽(yáng)性率59.1%。20例良性肺疾病患者和10例健康對(duì)照者外周血中SP-C mRNA均陰性，SP-C mRNA在肺癌組與對(duì)照組中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.33，P＜0.01)，見(jiàn)表 1。

2.3 外周血中SP-C mRNA表達(dá)與肺癌患者臨床病理生理特征關(guān)系 44例肺癌患者中大于55歲與小于55歲的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);男、女之間的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);TNM分期中，(Ⅰ+Ⅱ)期與Ⅲ期之間的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肺癌不同病理分型中，腺癌與鱗癌之間的陽(yáng)性率比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);低分化與高分化之間的陽(yáng)性率比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表1 NSCLC患者及對(duì)照組外周血中SP-C mRNA的表達(dá)

表2 NSCLC患者外周血中SP-C mRNA表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者生存的主要因素之一。在肺癌的治療方法中，除ⅢB及Ⅳ期之外，均應(yīng)以手術(shù)治療為主導(dǎo)，但即使是病理分期為Ⅰ期(T1N0M0、T2N0M0)的NSCLC患者在手術(shù)后仍可有約30%的患者早期復(fù)發(fā)，而且復(fù)發(fā)方式多為腦、骨、肺等的血行性轉(zhuǎn)移，從這方面來(lái)看，說(shuō)明手術(shù)時(shí)，其切除范圍以外的血液中就已有隱匿或微量癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞存在。

外周血中并不含有RNA，因其對(duì)降解酶具有高度的敏感性，血液中具有腫瘤特征性的mRNA只可存在于有活性的和完整形態(tài)的腫瘤細(xì)胞中。所以，在外周血中檢測(cè)到特異性的mRNA存在就可以用來(lái)說(shuō)明循環(huán)中有微量癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞的存在［3］。隨著RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，使得通過(guò)外周血來(lái)檢測(cè)微量癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞成為可能。本實(shí)驗(yàn)選擇SP-C基因作為檢測(cè)分子標(biāo)志，用RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)肺癌患者的外周血，表明SP-C mRNA作為檢測(cè)肺癌外周血微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物具有良好的敏感性和特異性。實(shí)驗(yàn)表明，NSCLC患者外周血發(fā)生微轉(zhuǎn)移與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)，與疾病TNM分期、組織病理學(xué)類(lèi)型和癌細(xì)胞分化程度相關(guān)。如果在外周血中檢測(cè)到癌細(xì)胞可表明癌細(xì)胞較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能，預(yù)示著其預(yù)后欠佳。因此，綜合考慮肺癌患者外周血SP-C mRNA表達(dá)情況與影像學(xué)表現(xiàn)，將會(huì)有助于更準(zhǔn)確地判定肺癌患者的分期，制定更加合理的治療方案，有助于提高治療效果和改善預(yù)后。

SP-C是特異性的Ⅱ型細(xì)胞分泌蛋白，含有33～35個(gè)氨基酸殘基，成熟的SP-C為單一性疏水性脂蛋白，1個(gè)成熟SP-C活性肽的單位相對(duì)分子質(zhì)量是42 ku。SP-C相應(yīng)的基因定位于人的8號(hào)染色體斷臂上。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial type Ⅱcell，AE2 cell)主要的生理功能是合成、貯存、分泌表面活性物質(zhì)(PS)，在肺上皮更新的過(guò)程中和組織損傷修復(fù)的過(guò)程中起著干細(xì)胞作用，且具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能及分泌生物活性物質(zhì)的能力［4－5］。肺表面活性物質(zhì)主要是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，具有增強(qiáng)免疫防御，降低肺泡氣液界面表面的張力，調(diào)節(jié)氣道內(nèi)液體平衡等功能。其中肺表面活性物質(zhì)蛋白(SP)發(fā)揮了重要的作用。SP主要有A、B、C、D 4種，其中SP-C是肺泡Ⅱ型細(xì)胞分泌的特異性表面活性蛋白。SP-C為PS中含量不足1%的非極性的表面活性蛋白，是一種肺部特有的蛋白質(zhì)，且具有重要、特殊的功能。目前其主要功能之一是在呼氣的過(guò)程中將非二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)脂質(zhì)排出氣-液界面，從而保證了脂質(zhì)層的表面生理活性［6］?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究主要集中在 SP-A、SP-D，而關(guān)于SP-C基因、蛋白的表達(dá)變化情況與肺組織疾病關(guān)系的研究報(bào)道較少。Betz等［2］研究發(fā)現(xiàn)，以肺表面活性蛋白mRNA作為轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物，進(jìn)行了肺癌患者淋巴結(jié)的檢測(cè)，在106個(gè)非異常淋巴細(xì)胞中檢出了1個(gè)癌細(xì)胞，且在轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者的淋巴結(jié)中檢出來(lái)其表達(dá)亦呈陽(yáng)性，對(duì)照組全部為陰性，該實(shí)驗(yàn)顯示了其作為檢測(cè)肺癌發(fā)生早期轉(zhuǎn)移指標(biāo)的價(jià)值。

AE2細(xì)胞也可以作為抗原呈遞細(xì)胞，其在一定的生理?xiàng)l件下能表達(dá)組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類(lèi)分子，從而具有一定的免疫作用，可分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，參與炎癥細(xì)胞間的相互作用，可被看作是一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，起到了肺部免疫調(diào)節(jié)和防御的作用［7－8］。由于抗原呈遞細(xì)胞表面的組織相容性復(fù)合物Ⅱ類(lèi)分子與抗原相結(jié)合，表達(dá)于細(xì)胞的表面，呈遞給T細(xì)胞，T細(xì)胞相應(yīng)活化、增殖，從而啟動(dòng)了抗原特異性免疫反應(yīng)。肺部免疫功能及機(jī)體的全身免疫功能強(qiáng)弱與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是呈負(fù)相關(guān)的。有研究表明，老年肺的特點(diǎn)使得AE2細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生退行性的改變，導(dǎo)致肺對(duì)外界致病因素的抵抗力減弱，從而易發(fā)生肺癌疾病。由于SP-C是AE2細(xì)胞分泌的特異性表面活性蛋白，如通過(guò)肺癌患者外周血中檢測(cè)到其高表達(dá)，可以進(jìn)一步探討該蛋白是否影響到患者肺局部免疫及全身免疫，從而來(lái)進(jìn)一步明確其是否影響肺癌患者的轉(zhuǎn)移及預(yù)后。為了揭示該分子標(biāo)志物作為肺癌早期轉(zhuǎn)移檢測(cè)指標(biāo)的價(jià)值，尚需對(duì)本組患者進(jìn)行隨訪(fǎng)檢測(cè)。

［1］OSAKI T，OYAMA T，GU CD，et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage Inon-small-cell lung cancer［J］.JClin Oncol，2002，20(13):2930－2936.

［2］BETZ C，PAPADOPOULOS T，BUCHWALD J，et al.Surfactant protein gene expression in metastatic and micrometastatic pulmonary adenocarcinomas and other non-small-cell lung carcinomas:detection by reverse trarscriptase-polymerase chain reaction［J］.Cancer Res，1995，55(19):4283－4286.

［3］VON KNEBEL D，LACROIX J.Nucleic acid based techniques for the detection of rare cancer cells in clinical samples［J］.Cancer and Metastasis Rev，1999，18(1):43－46.

［4］金婧，魏克倫.肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白與臨床肺疾病［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，2003，30(3):130－132.

［5］趙曉巍，劉又寧.肺表面活性物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37(4):4－7.

［6］HAFNER D，GERMANN PG.A rat model of acute respiratory distress syndrome(ARDS)Part 2，influence of lavage volume，lavage repetition，and therapeutic treatment with SP-C surfactant［J］.J Pharmacol Toxicol Methods，1999，41(2－3):97－106.

［7］CHARBENEAU RP，CHRISTENSEN PJ，CHRISMAN CJ，et al.Impaired synthesis of prostaglandin E2 by lung fibroblasts and alveolar epithelial cells from GM-CSF/mice:implication for fibroproliferation［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，284(6):1103－1111.

［8］ZISSEL G，EMST M，RABE K，et al.Human alveolar epithelial cells type IIare capable of regulating T-cell activity［J］.JInvesting Med，2000，48(1):66－75.