周 玨，盧林明，張根葆

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理解剖學(xué)教研室;2.病理生理學(xué)教研室;3.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒具有廣泛的生物學(xué)活性，是一種天然的藥用資源［1－2］。蝮蛇是我國分布最廣、數(shù)量最多的一種毒蛇，蝮蛇蛇毒含有多種抗凝、抗血栓及抗腫瘤的活性成分，由于蝮蛇生長環(huán)境的不同，不同地域的蝮蛇蛇毒各組分及作用也不盡相同，本校蛇毒研究所通過改良蛇毒分離純化技術(shù)，從皖南產(chǎn)蝮蛇蛇毒中提取了一種抑瘤組分Ⅰ(Agkistrodon Halysvenom antitumor component-Ⅰ，AHVAC-Ⅰ)。前期研究已證實(shí)具有高效低毒的抗凝、溶栓作用，其機(jī)制可能與影響血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。為進(jìn)一步了解對腫瘤的影響，本實(shí)驗(yàn)以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901為對象，觀察AHVAC-Ⅰ對其生長增殖的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 AHVAC-Ⅰ干凍粉由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提供。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Hyclone);胎牛血清(杭州四季青公司);青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液、CCK-8試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司(貨號:KG026)。細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化1∶2傳代，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI1640中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，每隔1～2 d換液、傳代，至對數(shù)增長期，收集細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8比色法 取對數(shù)增長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度(1×104/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中過夜，將AHVAC-Ⅰ干凍粉溶解于培養(yǎng)液中，稀釋、配制成各濃度AHVAC-Ⅰ(0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 μg/ml)，設(shè)空白組、陰性對照組及陽性對照組(50μg/ml 5-Fu)，每組設(shè)4復(fù)孔;培養(yǎng)箱孵育24 h，每孔加20μl CCK-8溶液，孵育2 h后充分振蕩，酶標(biāo)儀上450 nm波長檢測每孔吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(IR);計(jì)算公式為:IR=［1－(實(shí)驗(yàn)組OD－空白組OD)/(陰性對照組OD－空白組OD)］×100%;改良寇氏法計(jì)算IC50。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1 光鏡直接觀察 將細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中(5×105/孔)，培養(yǎng)箱孵育過夜，加AHVAC-Ⅰ溶液孵育24 h，濃度及分組同1.3，倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.4.2 HE染色觀察 將細(xì)胞懸液(5×105/孔)加入放置滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，制備細(xì)胞爬片，培養(yǎng)箱孵育過夜，加AHVAC-Ⅰ溶液孵育24 h，濃度及分組同1.3，取出蓋玻片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察、拍照。

1.5 TUNEL法 制備細(xì)胞爬片，加 AHVAC-Ⅰ溶液，濃度及分組同1.3，孵育24 h后取出爬片進(jìn)行原位末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說明書。光鏡觀察計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，計(jì)算方法:400倍鏡下隨機(jī)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)(核為藍(lán)黑色)，AI=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) ×100%，重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 AHVAC-Ⅰ對 SGC-7901的生長抑制作用CCK-8結(jié)果顯示與陰性對照組比較，經(jīng)AHVAC-Ⅰ處理24 h后，SGC-7901細(xì)胞的生長增殖明顯抑制(P＜0.01)，并且呈濃度依賴性，IC50 為 58.197 μg/m l;各組吸光度及抑制率見表1。

2.2 AHVAC-Ⅰ作用于SGC-7901的形態(tài)學(xué)變化陰性對照組細(xì)胞呈多邊形，貼壁生長，核分裂像較多;經(jīng)AHVAC-Ⅰ處理24 h后，細(xì)胞生長受抑制，倒置顯微鏡下見細(xì)胞密度稀疏，隨濃度增高出現(xiàn)懸浮、固縮等凋亡現(xiàn)象，高濃度時(shí)可見較多凋亡小體及細(xì)胞碎片，見圖1;HE染色后細(xì)胞形態(tài)變化同上，可見凋亡細(xì)胞及凋亡小體，見圖2。

2.3 AHVAC-Ⅰ誘導(dǎo) SGC-7901凋亡的情況0.3μg/ml AHVAC-Ⅰ組細(xì)胞凋亡指數(shù)與陰性對照組相比無差異(P＞0.05)，濃度≥1.0 μg/ml的細(xì)胞凋亡指數(shù)與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0 5或P＜0.01)，并呈濃度依賴性，見表2。

表1 AHVAC-Ⅰ對SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s，n=4)Tab1 The inhibition effect of AHVAC-Ⅰon SGC-7901 cells(±s，n=4)

表1 AHVAC-Ⅰ對SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s，n=4)Tab1 The inhibition effect of AHVAC-Ⅰon SGC-7901 cells(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs陰性對照組

組別OD(ˉx±s)IR(%)空白組0.043 ±0.056－陰性對照組 0.966±0.020－陽性對照組 0.459 ±0.013 55.00 0.1μg/ml 0.988 ±0.020－2.38 0.3μg/ml 0.938 ±0.010* 3.01 1.0μg/ml 0.868 ±0.020＊＊ 10.59 3.0μg/ml 0.802 ±0.027＊＊ 17.72 10μg/ml 0.740 ±0.029＊＊ 24.49 30μg/ml 0.585 ±0.016＊＊ 41.26 100μg/ml 0.459 ±0.011＊＊ 54.94 300μg/ml 0.439 ±0.009＊＊ 57.11 F 值 576.02 P值 ＜0.01

表2 AHVAC-Ⅰ作用SGC-7901細(xì)胞24 h的凋亡指數(shù)(±s，n=3)Tab2 Apoptotic Index of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰfor 24 h(±s，n=3)

表2 AHVAC-Ⅰ作用SGC-7901細(xì)胞24 h的凋亡指數(shù)(±s，n=3)Tab2 Apoptotic Index of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰfor 24 h(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs陰性對照組

組別凋亡指數(shù)AI(%，ˉx±s)陰性對照組2.20 ±0.20 0.3μg/ml 2.47 ±0.64 1.0μg/ml 4.60 ±0.72*3.0μg/ml 9.73 ±0.50＊＊10μg/ml 26.73 ±1.33＊＊30μg/ml 69.53 ±1.62＊＊F 值 2 220.27 P值 ＜0.01

3 討論

我國胃癌的發(fā)病率居各類腫瘤的首位，臨床治療依舊采用手術(shù)切除、術(shù)后化療的傳統(tǒng)方法，所用的藥物多為化學(xué)合成藥，副作用較大且易產(chǎn)生耐藥。研究證實(shí)從蛇毒中分離純化的多種活性成分，可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的高粘附性、抑制腫瘤血管生成、直接殺傷腫瘤細(xì)胞及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑起到抗腫瘤的作用［3－5］，表現(xiàn)出較高的特異性和敏感性［6－8］;同時(shí)作為一類天然毒蛋白，其毒副作用較小，已成為抗腫瘤藥物研制開發(fā)的重要方向和研究熱點(diǎn)。本校蛇毒研究所從皖南蝮蛇毒中分離純化的抑瘤組分Ⅰ(AHVAC-Ⅰ)具有抗血小板凝固、抗血栓形成、改善微循環(huán)等多種作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在體外可抑制白血病細(xì)胞的生長增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究、分析了不同濃度的AHVAC-Ⅰ對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901生長增殖及凋亡的影響。

CCK-8法顯示0.3 μg/ml的 AHVAC-Ⅰ即可抑制SGC-7901細(xì)胞的生長(P＜0.05)，1～300μg/ml時(shí)細(xì)胞生長被顯著抑制(P＜0.01)，抑制率隨濃度增加而增加，證實(shí)AHVAC-Ⅰ可抑制SGC-7901的生長增殖，呈濃度依賴性，24 h的IC50為58.197μg/ml，且與5-Fu抗腫瘤的效果相近。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)縮小變圓、懸浮、核固縮、崩解等凋亡現(xiàn)象，HE染色后可見典型的凋亡細(xì)胞及凋亡小體。TUNEL法顯示經(jīng)AHVAC-Ⅰ處理24 h后SGC-7901發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)隨藥物濃度增加而增加。綜上所述AHVAC-Ⅰ對SGC-7901的生長增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，誘導(dǎo)凋亡可能是其作用機(jī)制之一。

圖1 AHVAC-Ⅰ處理24 h 后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化(倒置顯微鏡，×200)Fig1 Morphological changes of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰ for 24 h(under inverted microscope，×200)

圖2 AHVAC-Ⅰ處理24 h 后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化(光鏡，HE染色，×400)Fig2 Morphological changes of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰ for 24 h(under optical microscope，HE staining，×400)

細(xì)胞凋亡是由kerr等在1972年首次提出［9］，它是指由基因控制的細(xì)胞主動發(fā)生的一種程序性的細(xì)胞死亡，對生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)的平衡以及各種病理過程有重要意義。許多研究旨在發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡且安全有效的天然抗腫瘤藥用資源，其中蛇毒成分的研究比較充分，資料顯示其具有抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)皖南蝮蛇毒中提純的AHVAC-Ⅰ可能是通過誘導(dǎo)凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖，有望成為新一代的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，其誘導(dǎo)凋亡的具體途徑有待于下一步的研究和探索。

［1］CALVETE JJ，MORENO-MURCIANO MP，THEAKSTON RD，et al.Snake venom disintegrins:novel dimerle disintegrins and structural diversification by disulphide bond engineering［J］.Biochem J，2003，372:725－734.

［2］倪勝輝，孫晉民.蛇毒抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2010，25(6):473－475.

［3］CI-HUI YAN，ZHENG-HONG QIN，PAUL REID，et al.Contributions of autophagic and apoptotic mechanisms to CrTX-Ⅰnduced death of K562 cells［J］.Toxicon，2006，47(3):521－530.

［4］RODRIGUES RS，IZIDORO LF，DE OLIVEIRA RJ JR，et al.Snake venom phospholipases A2:a new class of antitumor agent［J］.Protein Pept Lett，2009，16:894－ 898.

［5］韋世秀.廣西眼鏡蛇毒對人類小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株的抑制作用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(21):3231－3234.

［6］JIANG JF，LIU W J，DING J.Regulation of telomerase activity in camptothecin-induced apoptosis of human leukemia HL-60cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2000，8:759－764.

［7］李欽章，黃沿中，楊冠群.眼鏡蛇膜毒素與單克隆抗體偶連物對鼻咽癌細(xì)胞的特異性殺傷作用［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，19(3):94－99.

［8］董慶華，鄭樹，呂慶華，等.浙江蝮蛇毒誘導(dǎo)人白血病Jurkat細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22(11):851.

［9］KERR JFR，WYLLIE AH，CURRIE AR.Apoptosis a basic biological phenomenon with wide rang-ing implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239－ 250.